1、细胞增殖及细胞活力检测方法细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。用于检测细胞增
2、殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力
3、。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DN
4、A，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不
5、存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书）在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一种四唑盐试剂WST-1来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切WST1试剂，产生一种水溶性的formazan盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是Calbi
6、ochem公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用calcein-AM（一种荧光探针）来标记细胞。这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用PBS替代培养基或血清来减小背景。Invitrogen公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内ATP水平的方法。健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生ATP。因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。自由基（Free Radical, FR）是含有孤电子的原子或原子团，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢（H2O
7、2）、单线态氧、羟自由基（HO）、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。 FR和ROS在细胞内可通过酶反应和非酶反应产生。其中线粒体是细胞内FR和ROS产生的主要来源，约占细胞内FR和ROS总量的98%左右1，由于线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)浓度较高，大部分O2-歧化为H2O2，后者可穿过线粒体膜进入胞浆。细胞内膜系统如滑面内质网及过氧化物酶体里含有一些酶, 如细胞色素p-450和b3家族、乙醇酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，这些酶对脂溶性药物、不饱和脂肪酸、抗生素及其它代谢产物的氧化，亦可产生H2O2和 O2-等2，3。除此以外，一些可溶性氧化酶、吞噬细胞NADP氧化酶、磷脂酶A2
8、(PLA2)等催化的反应，以及某些小分子的自氧化均是内源性ROS产生的重要来源1，配体反应也可介导产生FR和ROS4。 衰老的自由基学说认为，随着细胞复制衰老或生物整体衰老，FR和ROS在衰老的细胞和组织内累积，损伤生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等，造成其结构改变和功能丧失，甚至引起基因突变、DNA复制停止等，最终引起复制衰老和整体衰老，FR和ROS经由哪些途径引起衰老的呢？1FR和ROS可改变细胞的氧化还原状态。细胞内的氧化还原状态主要由谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(TRX)两对缓冲对进行调节，FR和ROS可氧化GSH和TRX，改变细胞内相对稳定的氧化还原状态，进而影响信号传导5。2FR和
9、ROS通过氧化蛋白质侧链上关键的氨基酸残基，如丝氨酸的羟基和半胱氨酸巯基，进而改变蛋白质的结构、影响蛋白质多聚化、蛋白质与Fe-S或其它金属离子的结合等。如被氧化修饰的-OH或-SH位于酶的催化中心，则酶的催化活性丧失；如被氧化修饰的氨基酸残基位于DNA结合域，则转录因子失去了与DNA结合及调控转录的能力；而蛋白质若不能与Fe-S结合，则呼吸链电子传递及氧化磷酸化受阻。另外，损伤的蛋白质半寿期延长，而衰老的细胞中蛋白质合成速率下降，导致受损伤的蛋白质更新率下降6。3 FR和ROS可氧化DNA，使其断裂或突变，DNA复制和转录受阻7，8。如果FR和ROS 导致的DNA单链断裂发生于染色体端区末端
10、，则端区缩短加快。在正常培养条件下，人二倍体成纤维细胞的端区缩短速率主要取决于细胞内的氧化压力9。4 FR和ROS加速了细胞内非酶糖基化反应，以及大分子如蛋白质之间的交联10。5 FR和ROS损伤端区，可能引发了衰老相关基因如p16和p21的过表达。 MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3
11、H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1.MTT法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲
12、（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲 ，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲 产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲 的有机溶剂对实验者也有损害。2.XTT法XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-
13、sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲 产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲 产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。3.CCK-8法或称WST-8法CCK-8试剂中含有WST8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸
14、苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 产物（Formazan）。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即
15、开即用。缺点:1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。三种方法的比较MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性难溶性水溶性水溶性检测波长490 nm450nm450nm性状粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用毋需预制使用有机溶剂DMSO或其它溶剂方便性+检测速度+重复性+稳定性+工作量-对细胞毒性-对人体毒性-一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量
16、分析和分选的技术。简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM 以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。（二）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分
17、别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。（三）流式细胞仪检测的细胞特性细胞结构组成 细胞功能大小 细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度 细胞活性DNA、RNA 含量 胞内细胞因子蛋白质含量 激素结合位点钙离子、pH 值、膜电位 酶活性人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞自杀，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能
18、对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。领导这一研究的是麻省大学医学院Joel D. Richter教授，这位科学家对于发育与疾病过程中的调控机制十分感兴趣，至今已发表相关研究成果多项，尤其是有丝分裂，减数分裂过程中的机制。mRNA的3端被一段“非模板”的腺嘌呤（即polyA尾端）所覆盖，其作用是增强它们的翻译。polyA聚合酶Gld2被序列特异性CPEB蛋白引导到3端未翻译的区域。在这篇文章中，研究人员发现p53肿瘤抑制因子不只是简单地被Gld2多聚腺苷酰化。而是Gld2可以将一个A添加到miR-122小RNA上，从而使其稳
19、定。这种腺苷酰化的miR-122/RISC复合物然后通过在其3端未翻译区域结合目标点来抑制CPEB的表达。如果CPEB不被miR-122抑制，那么CPEB将与p53的3端未翻译区域结合，并结合一种不同的polyA聚合酶，即Gld4。这些数据反映了p53 mRNA的翻译控制的一个以前人们不知道的层级关系，这一层级关系导致细胞衰老。这种小RNA：miR-122具有许多重要的作用，之前的研究发现肝癌组织miR-122的表达与肝癌细胞周期调控密切相关，最近的研究又显示，miR-122可以通过影响p53蛋白的稳定性和转录活性，调节细胞周期蛋白Cyclin G的表达，从而降低癌细胞的侵袭性。这些都说明了这
20、种小分子与p53的关系密切。这对于深入了解p53的作用具有重要的意义。除此之外，有关p53，近期布鲁塞尔自由大学的研究人员也获得了新进展，他们证实一个重要的肿瘤抑制因子p53的某些突变可导致蛋白质发生错误折叠从而在细胞内积聚。这不仅破坏了正常p53的保护功能，同样还可累积其他相关蛋白，从而导致癌症的发生。过去的研究表明大约有一半的癌症中都存在p53基因突变，从而科学家们将其视为开发新型癌症治疗的重要靶点。而这项研究揭示了突变p53在癌症中一个新的作用机制：p53突变使得p53蛋白丧失了它的保护性功能，并导致这些蛋白质改变形状，相互之间发生聚合，开始在细胞内积聚。研究结果表明大约1/3的p53突
21、变细胞存在这样的作用机制。研究人员还发现突变可能导致p53获得了完全不同的特性，进而从抑癌因子转变成为了加速肿瘤生长的物质。在进一步的研究中，研究人员发现突变p53似乎还与细胞内的调控分子p63和p73形成了积聚物，从而导致这些调控分子丧失了自身的功能。美国Brown大学最新研究发现，即使在果蝇神经细胞中的瘤抑制蛋白p53的活性降低的情况下，果蝇仍然能健康存活很长时间。 论文发表在最新一期的国际生物学期刊Current Biology中，研究结果为p53的功能研究提供了重要的信息，基因组的守护神p53对抗衰老药物的研究也具有一定的参考价值。 P53基因在体内具有重要的地位。它通过产生一种能引发
22、细胞调亡的蛋白质来保护人类细胞，或是在DNA受到严重损伤时促使细胞自杀，这样便可以阻止遗传突变的扩展和癌症的形成。当p53受损或缺失时，就会导致癌症。实际上，有53的癌症患者携带有p53突变体。 然而，当人类的守护基因p53极度活跃，瘤抑制蛋白比正常水平更高的时候，老鼠的衰老进程就会加速并且寿命缩短。 生物学家Stephen Helfand等的研究显示，p53基因中存在一个“临界点”。如果p53蛋白的含量低于这个临界点，尤其是神经细胞中的p53，便能延长果蝇的健康生存时间。因此， p53活性的降低对衰老会产生重大的影响。 美国康涅狄格大学的研究人员发现对p53蛋白进行修饰可以延长寿命，Brow
23、n大学的Helfand教授等用果蝇进行了检测试验。因为果蝇中有数千个基因与人类相似，并且它也表达p53基因。 试验中用的果蝇携带有p53的突变体，当突变基因表达后，会产生一个突变体进而形成新的p53蛋白，该蛋白会使正常的p53蛋白失活，不过这种影响只发生在神经细胞中。为什么挑选神经细胞来做试验呢？因为成熟的神经细胞不会分裂，这样发展为癌症的几率就比较小。 研究结果显示，携带成熟突变体的果蝇中58都会长寿，平均寿命为60天，而正常情况下果蝇的平均寿命为38天。与此同时，果蝇还会健康生长，还会继续取食、运动以及繁殖后代。 但是，目前的试验还不能解释为什么p53活性的降低能延长寿命。有现象暗示这是卡
24、路里限制的原因，这一生化机理可以延缓衰老。为了检验这个设想，研究人员不进行卡路里限制，饲养了一些果蝇，发现果蝇不再长寿，这表明了该途径是存在的。p53和pRB蛋白是两种关键的肿瘤抑制因子，在诱导衰老方面有着决定性的作用，一般我们说的两条衰老信号通路是指pRB信号通路和p53信号通路。人类的细胞衰老通路表现为两条平行的（与小鼠的一条形成对比）通路，这样将使得细胞不容易绕过衰老过程，从而抑制了肿瘤的发生。但是这种设想受到了近年来的一些实验的挑战，如人的肺成纤维细胞，通过体细胞同源重组技术，使得p53或PRB失活，可以避开衰老过程，这就有些像小鼠身上的单线状的衰老通路(Wei et al., 200
25、3)；而且，与小鼠形成对照的是，通过同源重组导致的p21的失活足以避开衰老过程，表明了p21作为p53和PRB两通路的联系者的身份(Brown et al., 1997a)。关于p53和PRB蛋白的作用，现在有一种比较认可的看法是：p53通路介导的是端粒功能异常、DNA损伤引起的衰老过程；p16/pRB通路介导的是致癌基因的表达、染色质断裂、多种多样的胁迫等等引起的衰老过程(Wright and Shay, 2002; Collins and Sedivy, 2003; Ben Porath and Weinberg, 2004)。但是现在这两条通路的标志性分子尚未找到，并且在不同种、组织的细
26、胞中两条通路的重要性又有所不同，所以对于衰老通路的理解正处于不断深化的过程中。下面简单看一下两个通路情况：(一) p53通路p53蛋白可以激活下游分子，如p21CIP1/WAF1(Kulju and Lehman, 1995)，或是其他的蛋白分子来激活pRB实现衰老过程（小鼠）；而且，在人身上，可以不依赖PRB激活衰老。p53的失活会导致一些复制型衰老的细胞彻底地逆转衰老过程(Gire and Wynford-Thomas, 1998)。类似地，p21（p53的转录激活的靶子，是一种细胞周期循环的抑制分子）的失活，会使得细胞绕过端粒依赖的复制型衰老，进入一种危机状态(Brown et al.,
27、 1997b)。p53的激活是通过磷酸化（ATM/ATR，Chk1/Chk2蛋白分子的功劳），p19(ARF)(抑制Mdm2)的激活来实现。p53在细胞对DNA损伤反应（包括衰老反应）过程中是一个关键性的调节因子(Wahl and Carr, 2001)。在人的细胞中，p53的缺失会延迟或是阻断复制型衰老(Itahana et al., 2001)。致癌基因RAS的表达通过ROS来实现，而ROS是在促有丝分裂以及促细胞衰老的过程中是必需的。RAS的过量表达，可能会通过p53依赖的损伤反应（即产生大量的DNA损伤的ROS）来导致衰老反应；同时RAS也会诱导p16的表达，p16是pRB的激活剂(F
28、erbeyre et al., 2000; Pearson et al., 2000; Serrano et al., 1997)。两个蛋白都能阻碍潜在的肿瘤细胞的增殖。总之，在一些细胞中，DNA损伤引起的衰老感应，端粒异常，以及一些致癌性基因的表达会通过p53通路来导致细胞衰老，p53通路在当中起的作用不仅是必要而且还是充分条件。（二）pRB通路p53对于一些细胞逆转衰老抑制非常有效，但也不竟然(Beausejour et al., 2003c; Herbig et al., 2004b; Sakamoto et al., 1993)。有些细胞在p53敲除后，还能呈现衰老状态。这种细胞往往或
29、多或少地表达细胞周期的抑制因子p16。小鼠体内的研究表明p16阻碍了自发性的恶性肿瘤的发生(Sharpless et al., 2001)。细胞培养的研究表明，p16阻止了由p53失活引起的逆转衰老的现象；并且对RAS引导的衰老过程是必需的(Beausejour et al., 2003b; Benanti and Galloway, 2004a; Brookes et al., 2004)。p16的表达通过胁迫刺激来实现，如过量表达致癌基因RAS，或是相对艰苦的培养环境(Lowe and Sherr, 2003)；可以被p21,或是p16ink4a蛋白分子激活。p16是pRB的正向调节分子，
30、而且还能通过自己的信号通路来实现作为肿瘤抑制剂的功能(Sherr and McCormick, 2002)。值得一提的是，p21在抑制细胞周期依赖的激酶方面，是比p16更普遍的抑制剂，它可以导致磷酸化的程度降低，促进pRB的激活。在人的成纤维细胞中，如果p53失活，p21表达，细胞增殖过程仍可继续；但是如果p16表达了，那么增殖过程就会停止了。并且，在人的成纤维细胞中，p21和p16，一般是两者择其一表达，很少有两个都表达的(Herbig et al., 2004a)。pRB蛋白在衰老的过程中是以低磷酸化的活性状态体现活性的，通过结合E2F蛋白家族的成员来抑制目标基因的表达(Narita et
31、 al., 2003)。有趣的是，一旦pRB通路启动了之后（尤其是被p16启动的），就算是p53失活，p16沉默，或pRB失活都不能逆转衰老过程的发生(Beausejour et al., 2003a)。这个过程被认为是pRB在转录因子的目标基因或者是其他的基因池上，形成抑制性的染色质之后，维持异染色质的过程不需要p16或是pRB的参与。pRB通路在诱导有关衰老基因的表达方面鲜为人知。因为pRB/E2F并不直接调控那些在衰老细胞中高表达的基因，而是间接地控制这些基因（如沉默那些抑制因子，等等）。小鼠和人的细胞衰老途径有些不同。以前认为小鼠细胞的复制型或是端粒依赖型的衰老过程是主要通过p53来实
32、现的(Harvey et al., 1993; Smogorzewska and de Lange, 2002b)。但是，后来发现，小鼠细胞的这种衰老反映可能是由于氧毒害引起的（人为），然而，人的细胞对于氧的毒害反映比较轻(Smogorzewska and de Lange, 2002a; Parrinello et al., 2003)。除了这个区别外，小鼠细胞还能逆转由pRB引起的衰老状态(Sage et al., 2003b)，但人的细胞是不是也能适应高浓度的p16还不清楚。同时，在人的细胞中，p16在数量上似乎有一个“度”的概念，超过了这个度，将会使人的细胞对RAS诱导的衰老更加敏感，同时细胞也不再增殖
