1、基因工程思考题答案删减后学习第二章 1. 名词解释（1）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。（3）转位因子（transposableelements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。（4）基因组（genome）：细胞中，一套完整单倍体的遗传物质的总合。（5）启动子（promoter）：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小不等，具有转录目标基因的mRNA的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。（6）基因（gene
2、），基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。（7）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。（8）终止子（terminator），在基因3端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸短序列，具有终止转录的功能，叫做终止子（terminator）。（9）断裂基因（split gene），真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编码序列所打断，因而被称为断裂基因（split gene）。在编码序列之间的序列称为内含子（intron），被分隔开的编码序列称为
3、外显子（exon）。（10）顺式作用元件（cis-acting elements），指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。（11）反式作用因子（trans-acting elements），可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans-acting elements）。（13）反应元件（response elements），是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的DNA序列，被称为反应元件（response elements）。（14）增强子（enhance
4、r），是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件，反应作用因子与这些元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的转录。（15）转位因子（transposableelements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。（16）转座子（transposon，Tn），是一类较大的可移动成分，它是由几个基因组成的特定的DNA片段，除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基因（如抗药性基因）。（17）假基因（pseudogene），假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表
5、达异常，生成无生物活性的多肽。（18）重叠基因（overlapping genes），或嵌套基因（nested genes），是指基因的核苷酸序列（或阅读框）是彼此重叠的基因，称为重叠基因或嵌套基因。（19）基因家族（gene family），就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。（20）反向重复序列，是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。有两种形式，一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列；另一种形式是两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列，这种结构亦称回文结构（palindrome）。（21）看家基因（housekeeping gene），在几乎所
6、有细胞中或发育过程中持续表达的基因，被称为看家基因。（22）锌指（zinc fingers）结构，由约30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中 4个氨基酸残基（两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或4个都是半脱氨酸）以配位键与Zn2+相互结合，形成指状结构，常存在于真核转录因子的DNA结合结构域中。（23）亮氨酸拉链（leucine zippers），是指在一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基，这段肽链所形成的-螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条，两个具有亮氨酸拉链条的反式作用因子，能借疏水作用形成
7、二聚体。（24）基因重排（gene rearangement)，是指某些基因片段改变原来存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。（25）RNA编辑（RNA editing），是一种较为独特的遗传信息加工的方式，即转录后的mRNA在编码区发生核苷酸改变的现象，是在RNA分子上出现的一种修饰现象。（26）分子伴侣（molecular chaperone），是指能帮助新生肽链折叠，使之成为成熟蛋白质，但本身并不参与共价反应的物质，大部分为蛋白质。DNase超敏位点（hypersensitive site）：染色体DNA中转录较为活跃的区域，组蛋白相对缺乏，并对核酸酶（
8、DNase）高度敏感，故名。2. 简述乳糖操纵子中CAP的正性调节作用机制。降解物基因活化蛋白（catabolite gene activation protein，CAP）是一种同二聚体，其分子内有DNA结合区和cAMP结合位点。CAP与cAMP结合形成复合物才能刺激操纵子结构基因的转录。当葡萄糖浓度低时，会使cAMP浓度升高，形成cAMP-CAP复合物，并与启动子上游的CAP位点结合，刺激RNA聚合酶的转录作用，使转录效率提高50倍，然而这种作用的前提条件是无阻遏效应存在。当葡萄糖浓度较高时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，转录效率下降，由此可见，乳糖操纵子结构基因的高表达既需
9、要有诱导剂的存在（消除阻遏效应），又要求无葡萄糖或低浓度葡萄糖的条件（促进cAMP-CAP复合物的形成，刺激转录）。3. 比较原核基因组与真核基因组的结构与功能特点1原核生物基因组仅由一条环状双链DNA分子组成，含有1个复制起点，无染色体结构，基因的转录和翻译在同一区域进行。1多条染色体，两份同源的基因组，而原核生物的基因组则是单拷贝的。基因组庞大、复杂，具有许多复制起点，每个复制子大小不一。2具有操纵子结构这是原核基因组的一个突出的结构特点。2. 无明显操纵子结构，存在大量反式作用因子与顺式作用元件的相互作用调节3编码序列在基因组中约占50%编码顺序不重叠，其转录产物多为多顺反子结构。3非编
10、码的顺序占绝大部分，约占90%以上。基因组中非编码的顺序所占比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别。4多顺反子结构，无内含子，是连续的，因此转录后不需要剪切。4单顺反子结构，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。存在断裂基因。5基因组中重复序列很少5含有大量重复顺序，这是真核生物基因组的重要特点。6存在移动基因，包括插入序列和转座子6有基因家族，功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远。4. 简述真核表达调控的主要环节和调控方式。（一）DNA水平的调控：（1） 染色质结构对基因表达的调控作用，（2）基因修饰，（3） 基因重排，（4）基因扩增。（二）转录水平的调控（转录起始的
11、调控）（1）反式作用因子的活性调节；（2）反式作用因子与顺式元件的结合；（3）反式作用因子的组合式调控作用（三）转录后水平调控（1） “加帽”和“加尾”的调控；（2）mRNA选择性剪接对表达的调控 ；（3）RNA编辑的调控；（4）mRNA转运调节（四）翻译水平的调控（1）翻译起始调控；（2）mRNA稳定性对翻译的影响 （五）翻译后水平的调控（1）信号肽的切除；（2）新生肽链的修饰；(3) 肽链的剪接与正确折叠第三章1. 核酸分离纯化应注意哪些事项？一般的分离纯化分为哪些步骤？各步的要点是什么？分离纯化核酸应注意：应保证核酸一级结构的完整性，防止降解；排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的
12、研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。保持核酸的完整性，即保持其天然状态。细胞内的核酸酶活力很高，在制取过程中必须防止核酸酶对核酸的降解。防止化学因素(酸碱等)和物理因素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备RNA要特别注意防止核酸酶的作用，因为RNase分布很广，活力很高；而对DNA更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA分子特别长，容易断裂。核酸的纯化：首先是去除蛋白质。要点：从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。从核酸溶液中去除蛋白质常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少
13、蛋白质变性操作过程中产生的气泡。用氯仿抽提处理，去除核酸溶液中的痕量酚。要点：如果下一步骤中酶反应的条件要求严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68水浴中放置10分钟使痕量乙醚蒸发掉。6.PCR反应的基本原理是什么？每个循环包括哪些步骤？有何应用价值？PCR反应的基本原理：首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段单链DNA来启动（“引导”）新链的合成。每一个温度循环
14、周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤组成。应用价值：PCR技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的应用。9.PCR的引物设计应遵守哪些原则？如何对体系反应条件按优化？原则：PCR引物合成的DNA片段通常长1525碱基，其中GC约占50%。在设计时必须特别注意引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。引物的3末端必须与目的片段完全相配。引物的5末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。有时在扩增仅知其表达产
15、物的目的片段时，可以在引物中设计成简并密码子。体系反应条件按优化：首先是使模板DNA解离成为单链，这个过程可以通过加热完成，在9095条件下，根据模板DNA复杂程度，调整变性温度和时间。一般情况下选择94，30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。过高温度或高温持续时间过长，会对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害。变性后的DNA迅速冷却至4060，可使引物和模板DNA发生结合。复性温度的选择，可以根据引物的长度及其GC含量确定。长度在1525bp之间时，引物的退火温度可通过Tm=4（GC）2（AT）计算得到。PCR反应的延伸温度建议选择的7075之间，此时，Taq DNA聚合酶具有最
16、高活性。当引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。此时，可采用使反应温度缓慢升高到7075的方法。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的片段，延伸时间1分钟即可；扩增片段在1kb以上则需加长延伸时间。其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上2025次循环之后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中因此不管模板浓度是多少，2030次是比较合理的循环次数。10.解释以下名词：反向PCR，不对称PCR，反转录PCR，多重PCR反向PCR: 用于扩增位于靶DNA区段之外的两侧的未知DNA序列。不对称PCR：可用于制备单链模
17、板DNA。这种方法除了使用的两种引物浓度相差100倍之外，其它方面与标准的PCR并没有本质的区别。反转录PCR：用于扩增被反转录成cDNA形式的特定RNA序列。多重PCR技术：即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。12.简述核酸杂交的基本过程，核酸印迹转膜有哪些方法?核酸杂交的基本过程：将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，或直接在细胞内进行杂交的过程。核酸印迹转膜有：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。第四章1、什么是DNA限制性内切酶；基因工程中常用的是哪种类型，如何命名？答：DNA限制性内切酶：是能识别并切割双链DNA序列内部特
18、定核苷酸序列的DNA水解酶。它可以将外源DNA切断，从而限制外源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的 DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。基因工程中常用的是II型限制性内切酶。人们使用限制性内切酶寄主菌的种属名称，来命名限制性内切酶，即以微生物属名第1字母（大写）和种名前两字母（小写）写成斜体三字母，例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示。菌株名以非斜体在此三字母后，若菌株有几种不同限制性内切酶时，则以罗马字母区分，如Hind、Hind、Hind等等。4、利用逆转录酶和mRNA模
19、板合成cDNA的主要步骤是什么？答：（）以具有poly（A）结构的mRNA做模板，并以1218个碱基长的多聚胸腺嘧啶寡核苷酸oligo（dT）片段作引物，在逆转录酶的5-3聚合酶活性催化下，合成出与模版mRNA的单链互补的cDNA单链。具有poly（A）结构的mRNA是采用一定的抽提方法从生物体内分离纯化而来，在mRNA单链的3端是由一连串碱基A组成的多腺嘌呤尾巴。胸腺嘧啶可以与腺嘌呤配对互补，所以采用oligo（dT）做引物，与mRNA3端的poly（A）尾巴结合。（2）碱水解法除去mRNA模板之后，单链cDNA能够自我折叠形成发夹环结构，折叠的短链即成为第二条cDNA链合成的引物，反转录酶
20、或Klenow酶就可催化第二条链cDNA合成。（3）采用SI核酸酶消化法，除去单链区的发夹环结构，就可将获得完整的DNA分子。6、为什么通过碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用？答：碱性磷酸酶可催化除去DNA、RNA的5磷酸基团。碱性磷酸酶处理过的DNA片段缺少连接酶所要求的5磷酸末端，因此它们不能进行自我连接。在质粒载体与外源DNA连接构建重组质粒时，使用碱性磷酸酶处理酶切过的质粒，可以降低载体DNA的自连。第五章1.以pBR322为例，论述质粒载体必须具备哪些条件？（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。（2）带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。（3
21、）具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。2.试述噬菌体载体是如何进行构建的？（1）去除DNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。（2）去除多余的限制酶切割位点，确定12个单酶切位点作为克隆位点。（3）DNA的非必需区组入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。（4） 建立重组的DNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。5. 简述表达载体需要哪些基本元件？各有什么作用？在克隆载体的基础上，表达载体的构成特别强调与表达强弱相关的构成元件如启动子、终止子、核糖体结合位点等。（1）启动子：启动子位于转录起始点上游，是DNA链上一段能与RN
22、A聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，是启动基因转录所必需的一段DNA顺式调控元件。没有启动子，基因就不能转录。（2）终止子：在一个基因的3端或是一个操纵子的3端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。在构建表达载体时，为了防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。（3）核糖体结合位点：核糖体（rRNA）是蛋白质合成的场所，mRNA有效地翻译依赖于mRNA的稳定性及其与核糖体结合的能力。6.论述双元载体的概念及构建原理。双元表达载体由2个分别含有T-DNA和
23、Vir区的相容性突变Ti质粒构成，即微型Ti质粒（min-Ti plasmid）和辅助Ti质粒（helper Ti plasmid）。利用二元载体进行遗传转化时，首先要将外源基因构建到微型Ti质粒上，再将微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的土壤农癌杆菌菌株中，用该菌株侵染植物组织，含目的基因的T-DNA可整合到植物基因组中。双元载体不仅构建方便，而且其T-DNA整合进入植物细胞不需要带进许多冗余DNA序列，转化效率高于一元载体。第六章 1、克隆基因的方式有哪些？目前基因克隆的手段多种多样，概括起来主要包括两种策略：一种是构建大容量或者经特定手段优化的基因文库，然后利用一定的筛选方法从中分离、鉴定
24、出需要进行研究的目的基因；另外一种策略是在基因序列已知的基础上，通过PCR扩增、改造或者人工化学合成的方法获得目的基因。目前几种常见的基因克隆手段，如基因组DNA文库、cDNA 文库、PCR扩增法、人工化学合成法、差异克隆技术等。2、试述基因组文库的构建流程及其影响因素。构建流程一般来说，构建基因组文库的基本步骤有五步：高分子量DNA的制备；外源DNA片段与载体分子的重组；重组载体转化受体细胞；阳性克隆的挑选；基因组文库的评价和鉴定。影响因素（1）载体的种类与质量;（2）高分子量的染色体DNA的获得 ;（3）避免DNA的降解;（4）选用的限制性核酸内切酶对基因组DNA的切割频率及酶切反应条件。
25、;（5）插入DNA片段的大小;（6）插入DNA片段与载体的比例;（7）DNA的总浓度;（8）连接的温度3、用于扩增基因的PCR方法有哪些？各有什么特点？（1）RT-PCR法，是一种从细胞mRNA中高效扩增cDNA序列的方法，它将反转录与PCR扩增技术相结合。 （2）反向PCR，用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段，即根据已知的目的基因DNA序列设计引物，以已知序列和未知序列的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA序列。（3）锚定PCR，是一种根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知序列上游或下游片段的技术。（4）连接介导的PCR，在只知道DNA一端的序列的情况下，能够对未知的一端序列进
26、行测序和对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析。 （5）盒式PCR，盒式PCR可特异性地扩增cDNA或基因组DNA上的未知区域。（6）RACE，是一种通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的一种方法。4、什么是cDNA文库？它的基本构建流程是怎样的？以mRNA为模板，在体外经逆转录酶催化反转录成cDNA，与适当载体连接后转化受体菌并繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基本构建流程: 一般来说，构建cDNA文库的基本步骤有五步：制备mRNA；第一链cDNA合成；第二链cDNA的合成；双链
27、cDNA的修饰及克隆；对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库的代表性以及重组cDNA片段的序列完整性。7、人工合成长片段基因的方法有哪些？长片段基因的合成，通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段，先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因序列。包括退火-连接法、多步退火-延伸-连接法和由内向外多步退火-延伸合成法。12、转化后对重组子进行筛选的方法有哪些？重组子的筛选方法多种多样，是由载体的类型、插入DNA片段大小和性质，以及受体细胞的遗传特性等的不同决定的。主要包括两类：一、依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛
28、选，包括抗药性筛选法、显色筛选法、营养缺陷型筛选法和噬菌斑筛选法。二、菌落原位杂交法14、对DNA进行定点突变的方法有哪些？DNA定点突变的方法分为两大类。第一类是基于PCR的点突变，包括重叠延伸PCR 法、大引物PCR 法、特殊位置碱基的定点突变和扩增环状质粒全长的突变。第二类是不依赖于PCR的定点诱变方法，包括盒式诱变、寡核苷酸介导的诱变和Kunkel法第七章1. 什么是RBS？RBS在基因表达中有何作用？ RBS，即核糖体结合位点，是指紧靠启动子下游的，从转录起始位点开始延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码子AUG通常位于它的中心位置，是核糖体RNA识别与结合的位点。作用：SD序列
29、是翻译起始密码子（AUG）上游5-13个核苷酸处的一段富含嘌呤UAAGGAGGU的全部或者其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16S rRNA的3端相互作用，以正确定位起始密码子。2. 外源基因在原核生物中表达时，蛋白质的存在形式有哪些？各有什么优缺点？1包涵体表达：优点：包涵体的形成有利于防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解。缺点：包涵体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性；另外，由于表达产物形成包涵体，负责水解起始密码子编码的甲硫氨酸的水解酶，不能对所有的表达蛋白质都起作用，这样就可能产生N-末端带有甲硫氨酸的目的蛋白质的衍生物，而非生物体内的天然蛋白
30、，这可能会对某些蛋白质的性质产生影响。 分泌型表达： 优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的几率；通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。 融合型表达：优点：能以较高的效率进行，因为受体菌自身蛋白基因的SD序列和碱基组成等有利于基因的表达。外源蛋白以融合蛋白的方式表达时易于分离分离纯化，可根据受体菌蛋白的结构和功能特点，利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术分离纯化融合蛋白，然后通过蛋白酶水解或化学法特异性裂解受体菌蛋白与外源蛋白之间的肽键，获得纯化的外源蛋白产物。3. 分离纯化基因工程菌的表达产物策略
31、的制定要考虑哪些因素？ 表达系统的影响；表达产物性质的影响；初始物料、杂质等因素的影响；生产工艺、生产条件的影响。4. 分离纯化基因表达产物的过程一般包括哪些步骤？各有哪些细节需要注意？ 一般都包括对发酵液进行预处理、回收菌体、细胞破碎、离心分离、样品的浓缩与预处理、柱层析和电泳等步骤。1发酵液的预处理：主要包括改变发酵液物理性状（如加热、调节pH值、絮凝等） 以及改善固液分离特性（通过过滤等方法实现固液分离）两类方法，根据被分离物质的性质可选择某一种或者其中的几种方法相结合使用。2细胞分离：通过原核细胞培养获得的培养液，无论目标蛋白位于细胞内还是被分泌到细胞外的培养基中，首先都应该将细胞与培
32、养液进行分离，一般通过离心沉降或者过滤的方式进行分离。3细胞破碎：对于在胞内表达的蛋白质，将细胞与液态相分离后，就要考虑将细胞破碎，以使目标蛋白质从胞内释放到提取液中，然后进行目的产物的纯化。4离心分离：高速离心的离心力一般在10000g的范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等。如果基因表达产物是小分子可溶性蛋白，还可以进行超速离心（100000g以上）以除去细胞膜碎片等杂质。5柱层析：根据蛋白质的不同用途，需要对表达的特异性蛋白质进行进一步的分离纯化。6亲和层析：是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗原与抗体、受体与激素、酶与底物或抑制剂、操纵基因与阻遏蛋白、凝集素与糖类以及核酸与有关蛋白
