1、糖尿病肾病小鼠模型摘 要：糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是终末期肾衰的主要原因， 其发病机制至今尚未阐明。因此，建立理想的实验动物模型是研究糖尿病肾病发病机制、疾病防治、新药开发的关键环节。本文回顾并总结了各种糖尿病小鼠小鼠模型，为选择合适的动物模型应用于糖尿病肾病的研究提供参考。关键词：糖尿病肾病 小鼠模型糖尿病肾病( diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症, 是导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一，也是糖尿病病人的主要死因, 严重危害着人类健康。研究发现 DN 的发生可能与血流动力学改变、氧化
2、应激与糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、细胞因子作用以及遗传背景等多种因素密切相关1。但是，对 DN 发病机制尚不完全清楚,合适的 DN 动物模型的建立对于深入探讨DN 的发病机制及DN 治疗药物的开发具有重要的意义。2001 年，美国国立卫生研究所（National Institutes of Health,NIH）组建了糖尿病并发症动物模型工作组（Animal models Diabetic of Complica- tions Consortium，AMDCC），工作组致力于糖尿病并发症动物模型的建立和标准化。AMDCC 成立之初，即着手于定义各种糖尿病并发症动物模型的造模成功的准则。其中 DN
3、的准则2如下：(1) 整个生存期 GFR 至少下降 50%；(2) 与同一品系相同性别相同年龄的对照相比，造模动物尿蛋白增加超过10 倍;(3) 系膜基质增生，伴或不伴结节性硬化和系膜溶解，不同程度的小动脉透明样变，基底膜增厚超过基线水平的 50%，小管间质纤维化。理想的动物模型是应该具备上述准则的表型的，但实际中建立符合上述所有准则的动物模型是困难的。本文9 / 9将从药物诱导性模型、自发性模型、基因工程模型 DN 小鼠模型三方面对国内外的研究进展做一综述。1 化学药物诱导性模型制备DN 动物模型的诱发药物包括链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、四氧嘧啶(alloxan,AL
4、X)、链脲佐菌素联合弗氏完全佐剂以及四氧嘧啶加嘌呤霉素等。最 为 常 用 的 是 链 脲 佐 菌 素 (STZ) 。 STZ 是 属 于 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖（N-acetylglucosamine ，GlcNAc)的一种， 经由 GLUT-2 受体转运至胰岛 细胞。STZ 通过选择性抑制 O-连接的N-乙酰氨基葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase），导致胰岛细胞内蛋白质的不可逆的 O-糖基化，从而造成胰岛细胞的凋亡，丧失分泌胰岛素功能3。目前 STZ 诱导糖尿病肾病小鼠模型主要集中在型糖尿病，包括三种剂量的诱导。主要的造模小鼠品系有 C57BL/6、C57BLKS、Balb/c、DBA
5、2 等。1.1 低剂量STZ 多次诱导大量的实验研究已经建立了可信的低剂量STZ 多次诱导的DN 的小鼠模型的方案。AMDCC 的方案是7-8 周的小鼠禁食四小时，腹腔注射 50mg/Kg 的STZ， 连续五天。2 周内出现高血糖，5 周内开始出现蛋白尿。在早期，肾脏组织学主要表现为肾小球的肥大，可能主要是因为肾组织血流动力学的改变所引起的。之后，会出现系膜的扩张，一些品系的小鼠会发生系膜硬化。只有少数品系的小鼠（如KK）会发生小动脉透明样变和结节性硬化。Tesch 等 4提出 16-7 周的小鼠禁食 6 小时，腹腔注射 55mg/Kg 的 STZ，连续五天,相比 AMDCC 的方法，可以提高
6、 C57BL/6 造模的成功率，节省资源、避免动物的浪费。因为不同品系的遗传背景不同，对 STZ 的易感性不同，使的造模成功率也不同。Gurley 等鉴定出不同品系对低剂量 STZ 多次诱导糖尿病的易感性的顺序(DBA/2 C57BL/6 MRL/MP 129/SvEv BALB/c)5 。1.2 高剂量STZ 诱导AMDCC 高剂量 STZ 诱导 DN 的方法是小鼠禁食 4 小时，150mg/Kg 的 STZ 腹腔注射。高剂量STZ 的细胞毒性更强，加速胰岛细胞的破坏，导致造模小鼠糖尿病高发并且病情严重。高剂量 STZ 诱导的模型表现出更高的蛋白尿。但是高剂量的 STZ 同时会引起非特异性细
7、胞毒性，高糖引起肾脏病叠加在 STZ 引起的肾毒性， 使结果不易解释46。然而，高剂量 STZ 诱导的 DN 模型仍被广泛接受和应用，因为上述 STZ 潜在的肾毒性不是占据主导地位的，观察到在补充胰岛素控制血糖的情况下，糖尿病损伤可以逆转 7。Chow 等采用 STZ 125 mg/kg 腹腔注射C57BL/6 小鼠，连续两天诱导DN。 通过胰岛素治疗可以阻断肾脏病理形成，提示 STZ 并没有表现出肾毒性，最后的造模成功率接近 90% 8。2 自发性糖尿病肾病动物模型该模型是指动物未经过任何有意识的人工处置，在自然情况下发生的糖尿病， 或者由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物疾病模
8、型，进而发生糖尿病肾病。这类动物模型特点是种类有限，疾病动物饲养条件要求高，发病率低，病程长，价格昂贵，但在一定程度上减少了人为的因素，更接近自然的人类疾病，此类动物模型对 DN 的病因学研究有较高的应用价值, 主要用于 DN 的机制探讨和药效药理研究。可分为I 型糖尿病模型和II 型糖尿病模型。2. 1Akita 小鼠Akita 小鼠是C57BL/6 小鼠常染色体胰岛素的显性突变, 导致胰岛素A 链 96位发生半胱氨酸到酪氨酸的替代,引起错误折叠的胰岛素的蛋白毒性，造成选择性的胰岛细胞功能衰竭 9。动物 3 月后出现肾小球系膜扩张、基质积聚、足细胞损害、肾小球硬化及小管间质性纤维化等典型的D
9、N 的病理改变 10。但是与其他 C57BL/6 背景的 DN 小鼠模型相比，蛋白尿并不是突出性的特征(实验组10.232.73g/24h vs 对照组 13.98.8g/24h)11。2.2 NOD 小鼠NOD 小鼠产生自发性胰岛素依赖型糖尿病,是研究 1 型糖尿病的良好模型。NOD 小鼠与人类型糖尿病有诸多相似：遗传特异性的 MHC类等位基因和非 MHC 基因作为疾病的多个易感基因； 疾病是通过造血干细胞进行传代的； 胰岛内出现炎细胞浸润和抗胰岛素抗体 ; 疾病的发展高度依赖于 T 细胞的作用7。这种小鼠大概在 3 月龄时出现胰岛 b 细胞损伤，随着胰岛 b 细胞破坏加重会发生典型的糖尿病
10、，进而发展成为DN，表现为尿蛋白排泄增加。肾脏病理变化：系膜细胞增生，肾小球毛细血管基底膜增厚，细胞外基质增多，最后出现肾小球硬化12。NOD 小鼠可以用于研究转化生长因子（TGF-）、糖基化终产物（AGEs）在 DN 的系膜增生和硬化病理形成的作用13-16。2.3 LepRdb/LepRdb 小鼠LepRdb/LepRdb 小鼠是位于小鼠 4 号染色体的瘦素受体基因突变所致的先天肥胖性 2 型糖尿病模型。C57BLKS/J db/db 小鼠出生十天就可表现出高胰岛素血症， 10 周出现高糖血症（15.74.3mM）17。 8-16 周肾小球面积增加20%-30% 18 ,20-24 周系膜
11、基质增多，18 -20 月系膜基质增多、肾小球扩张、GBM 增厚明显，足细胞下有结节形成，但与 KM 结节不同,未观察到肾小管间质纤维化和小管萎缩19。2.4 KK Ay 小鼠KK Ay 小鼠是将毛色基因(Ay)突变引入到 KK 小鼠的 2 型糖尿病小鼠,。Ay 基因不仅影响小鼠的毛色而且可引起代谢紊乱，与 KK 小鼠相比 KK Ay 小鼠表现出更为明显的肥胖、高血糖、脂质代谢紊乱和高胰岛素血症等代谢异常综合征。8-16 周胰岛素水平显著增高，尿蛋白随着病情的进展不断升高，16 周出现系膜基质的增生和局灶增生性肾小球肾炎 20。KK 和 KK Ay 均可形成肾小球结节性硬化21。3 基因工程动
12、物模型基因工程动物是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为地修饰或改造，并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。利用之一技术，人们可以在动物基因组的特定位点引入所设计的突变基因，模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常；可以通过对基因结构进行修饰，在动物发生、发育的全过程中研究体内基因的功能及其结构功能之间的关系。尽管糖尿病肾病是由多基因控制的，但是通过构建单基因的缺陷的小鼠，可以为了解某种分子在疾病发生过程中作用提供一种方法。3.1 eNOS 敲除鼠敲除内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eN
13、OS)基因的C57BLKS/J db/db 小鼠，表现为高血糖、高血压、蛋白尿。26 周后其病理改变为肾小球系膜基质扩张、伴小动脉瘤的肾小球系膜溶解及 Kimmelstiel-Wilson 结节性改变22。eNOS 可以减少内皮细胞间连接的开放，降低血管通透性，不含 eNOS 基因的小鼠更易形成糖尿病肾病损伤。3.2 转基因 RAGE 小鼠DN 中 肾小球中有大量的糖基化终末产物（ advanced glycosylated endproducts , AGEs）堆积，特别是羧甲基赖氨酸的修饰23。其中由 RAGE( receptor for AGEs)与AGEs 结合可引起下游的一系列的效应
14、。如 Oldfield 等24体外证实AGE 可独立于 TGF-介导肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化 ，因此 AGE 可能在肾小管间质的纤维化的过程发挥着重要作用24。利用转基因技术，将人类 RAGEs 基因转入糖尿病鼠模型，使其血管内皮细胞过度表达 RAGE。4 月后转基因鼠肾脏体积增大，肾小球肥大，基底膜增厚，肾小球硬化，尿蛋白增加25。由于长期处于高糖环境中，动物模型体内大量的蛋白发生糖基化形成AGEs，转基因技术增加了该类模型中 RAGE 的表达，AGEs 与 RAGEs 结合效率增加，并通过激活 NF-kB 系统，介导了肾小球血管内皮细胞的炎症反应，从而导致肾脏病理改变。3.3 缓
15、激肽B2 受体敲除鼠研究表明血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme , ACE）基因表达增加 50%，仅对血压和血管紧张素 II 水平又轻微影响，但可导致缓激肽大量减少， 提示可能是缓激肽而不是血管紧张素II 在肾脏对糖尿病的应答中起着更为重要的作用26,27。于是AMDCC 研究员就着手靶向敲除 Ins2Akita/+ B6 小鼠缓激肽受体 B2(bradykinin 2 receptor , B2R) ，结果表明 24 周时编码 B2R 基因敲除的纯合子表现出蛋白尿增加 4 倍，更加广泛的系膜扩张，与人类的肾小球硬化相似28。同时小鼠表现出了肾组织和其
16、他组织线粒体 DNA 的损伤，提示细胞的衰老29。尽管 B2R 敲除加重肾脏病得机制尚不明确，但已发现在 B2R 敲除的小鼠肾脏中有 TGF-1、p53 等基因表达的增加29。Buleon 等30运用特异性的非肽的 B2R 受体阻断剂可以发挥 ACEI 类似的保护效应，如减少蛋白尿，抑制TGF-通路。4 结语随着 DN 动物模型研究的深入开展, 出现了一些比较理想的动物模型, 其肾脏的病理改变与人类比较相似, 为探讨 DN 的遗传背景起了重要作用。但是, 目前仍有许多问题有待解决, 通过药物诱发、动物杂交筛选及基因工程塑造的模型与人类的发病诱因并不一致,典型的肾间质纤维化病变不易出现 , 模型
17、在晚期并不出现肾功能衰竭等。寻求与人类病因、病程及病理改变均非常相似的动物模型, 仍是今后努力的方向与目标。参考文献1 黎磊石，刘志红.中国肾脏病学.北京：人民军医出版社.2008. 23 Lee T N, Alborn W E, Knierman M D, et al. The diabetogenic antibiotic streptozotocin modifies the tryptic digest pattern for peptides of the enzyme O-GlcNAc-selectiveN-acetyl-beta-d-glucosaminidase that co
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