1、环境工程微生物学实验讲义环境工程微生物学实验讲义实验一 光学显微镜的使用一、 目的要求1、 熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。2、 了解油镜的原理，并掌握其使用方法。3、学习生物图的绘制方法二、 实验内容学习普通光学显微镜的使用方法，学会判断是否需要使用油镜，学习理解，学习怎样使用和利用光圈，反光镜，调整反差，使视野达到最好的观察效果。学习使用油镜观察微生物标本示范片。观察的示范片有，细菌三型涂片、葡萄球菌涂片、枯草芽孢杆菌涂片、褐球固氮菌涂片、八叠球菌涂片、猪链球菌涂片，青霉、曲霉示范片等。三、 实验器材显微镜、各种示范片、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。四、 方法步骤1 用低倍镜对（调）光，
2、使视野明亮。2 选择要观察的标本片，首先在低倍镜观察（寻找观察目标）。3 高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4 油镜观察：高倍镜观察后上升镜筒（或者是下调载物台）油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴香柏油小心地下降镜筒使镜头浸在油里用粗螺旋将镜筒（载物台）缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰观察记录。5 观察完毕。上升镜筒（或者是下调载物台），转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。6 将显微镜各部分还原至进实验室时模样。五 结果与思考 1 绘图记录观察结果（以细
3、菌三型为例）细菌三型涂片观察放大倍数 目10物100_细菌三型涂片观察放大倍数目10 物1002 油镜完毕后，镜头应如何处理?六、讲解时的注意事项：1、本次实验为学生第一次进入微生物实验室，因此在开始实验时必须向学生交代实验室的一些规章制度及注意事项。2、对显微镜的介绍从原理到各部件到使用都务必详细，包括使用过程中应该注意的事项，尽量减少学生用坏仪器的几率。3、一定要详细讲解观察时视野内的反差调节，提高学生的实验效率。4、要提醒学生要掌握正确的观察方法，左眼观测，右眼用于画图或记录。养成良好的观察习惯。5、要要求学生实验报告绘图时必须采用铅笔。6、 要强调油镜护理的重要性。实验二 藻类、原生动
4、物及微型后生动物个体形态的观察（水处理中常见微生物的观察或活性污泥的观察）一、 目的要求1 进一步熟悉和掌握普通光学显微镜的使用方法。2 掌握生物图的绘制方法。3 学习压滴法制作标本片。二 实验内容用显微镜观察活性污泥。三 实验器材1、 实验室提供的水样：活性污泥混合液、生物滤池水样、SBR反应器水样、生物接触氧化池水样2、 学生自取水样（让学生来实验室之前自选地点取样，记录采样地点）3、 显微镜、吸水纸、擦镜纸。四 方法步骤1、 用压滴法制作藻类、原生动物和微型后生动物的标本片。2 、低倍镜观察（寻找观察目标）。3 、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4 、绘制藻类、原生动物和微型后生动物的
5、形态图。五 结果与思考 1 绘图记录观察结果藻类观察放大倍数原生动物观察 微型后生动物观察放大倍数放大倍数 2 你观察到几种微生物？来自不同水样观察到的结果是否不同六、讲解时的注意事项：1、要再一次强调显微镜的正确使用方法。2、再一次强调反差的作用。3、示范压滴法制作生物标本片的过程4、结合课堂内容，让学生明白使用显微镜观测活性污泥的意义，鼓励学生多做示范片，多认识几种原生动物等。5、再一次强调正确的观察方法。6、再次提醒学生注意使用铅笔绘图。7、提及PFU生物监测法，告诉学生此为开放实验，有兴趣的学生可以选择在实验结束选做。实验三、四 微生物细胞计数和大小的测量一 目的要求1 学习掌握血球计
6、数板进行微生物计数的方法。2 学习掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法。二 实验内容1 用血球计数板计算酵母菌悬液中，每毫升原液的菌数。2 用测微尺测量生物示范片中微生物的大小。三 实验器材1 菌种：酿酒酵母。2 仪器及其它：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸、各种生物示范片。四 方法步骤（一）微生物显微镜直接计数法1 制备酵母菌的菌悬液。2 取血球计数板一块，先用眼睛观察其结构，然后在低倍镜下观察计数室的网格结构。3 将盖玻片放在计数器的网格上方使之架起。4 用滴管吸取少许摇匀的酵母菌悬液，从盖玻片的一端注入，使酵母菌悬液渗入两玻片之间（应无气泡，盖玻片
7、不顶浮）。5 将计数板水平静置5分钟使菌液分布均匀后计数，。6 用低倍镜寻找计数器的网格，然后在高倍镜下按下述原则对上下两个计数室内的酵母菌进行计数。即：采用五点取样法（2516）或四点计样法（1625）各计上不计下、计左下计右的原则计数五个或四个中格中的酵母菌数。7 计算原菌液中含酵母菌数每ml原液中含酵母菌数=两次计数总酵母菌数/(280)400104稀释倍数每ml原液中含酵母菌数=两次计数总酵母菌数/(2100)400104稀释倍数（二）微生物大小测定1 目镜测微尺的校正（1）目镜测微尺装入目镜的隔板上，刻度朝下，将镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。（或将带有目镜测微尺的目镜头换上）（2
8、）从目镜中观察“目尺”的结构后，用低倍镜寻找镜台测微尺（先找黑圈，再稍加移动）。（3）移动台尺和转动目镜，使两尺平行，并把两测微尺一端的第一条线完全重叠，然后寻找另一端的一条完全重叠的线。（4）记下两重叠线之间的格数，并依下列公式求出校正值。校正值（微米）=两重叠线间镜台测微尺的格数/两重叠线间目镜测微尺的格数10微米（5）用同样的方法 ，求出高倍镜下目镜微尺的校正值。2 测量细菌的大小（6）取下台尺，换上生物示范片。（7）在油镜下测量每种细菌的3个细胞的大小。五 结果与思考1 填表：表一 微生物的显微计数（2516）12345小计总数细胞数/mL1室2室表二 不同物镜倍数的校正值物镜镜头镜台
9、测微尺（格数）目镜测微尺（格数）校正值低倍镜高倍镜油镜表三 油镜下细菌细胞大小的测定测量次数细菌名称测量参数目镜测微尺（格数）细胞实际大小1球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽2球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽3球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽2 为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？3 目镜测微尺在用前为什么要校正？六、讲解时的注意事项1、实验讲解务必详尽，不仅要跟学生讲实验原理，还要讲每一步操作的注意事项，比如在利用血球计数板计数时，如何找到计数室所在，利用测微尺校正时如和快速在油镜下找到镜台测微尺。这样使学生的实验效率提高，可以提高学生实验兴趣。2、示范利用血球计数板计数时，菌液如何添加。3、
10、强调测量大小时校正的原则：边对齐，整数格（不能出现小数），找最远的重合线。计数要防止重复计数注意的原则：数上不数下，数左不数右。实验五 微生物染色法一 目的要求1 学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。2 了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。二 实验内容1 分别以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌（E.coli）为材料进行革兰氏染色，并通过显微镜观察，判断其反应类型。同时说明单染色的操作技术和无菌操作技术。2 学习掌握细菌芽孢染色方法。三 实验器材1 菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。2 显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、
11、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。3 草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀绿溶液。四 方法步骤（一）单染色步骤1 涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2 干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3 固定：涂面朝上，通过微火2-3次。4 染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5 水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6 干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7 镜检：油镜观察并绘图。（二
12、）革兰氏染色步骤1 涂片：取清洁玻片一块，并滴一滴蒸馏水，将菌种涂布在蒸馏水中。2 干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤。3 染色：结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-干燥-镜检记录。（三）细菌的芽孢染色1 制备菌液：加1-2滴蒸馏水于试管中，从斜面挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。2 加染色液：加5%孔雀绿2-3滴于试管中用接种环搅拌，使其充分混合。3 加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。4 涂片：从试管底部挑菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜，晾干。5 固定：将涂片通过微火3次。6 脱色：水
13、洗，直到流出的水中无绿色为止。7 复染：加番红染色2-3分钟后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸去余水，于酒精灯火焰上烘干。8 镜检：用油镜观察绘图。五、结果与思考1 绘图记录观察结果（只要求记录革兰氏染色结果）革兰氏染色放大倍数_菌种_颜色_属性_ 革兰氏染色 放大倍数_菌种_颜色_属性_革兰氏染色 放大倍数_菌种_颜色_属性_2 在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？3 革兰氏染色中哪一步关键，为什么？六、讲解时的注意事项1、要强调无菌操作的重要性。2、示范无菌操作。3、强调挑菌、涂片过程应注意事项，挑菌不宜太多。否则涂片太厚4、示范革兰氏染色全过程5、强调酒精脱色的重要性6、强调涂片
14、必须干燥后才能置于油镜下观察实验六 细菌淀粉酶和过氧化氢的定性测定一 实验目的通过对淀粉酶和过氧化氢的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。二 实验器材1 药品及试剂：肉膏胨、淀粉琼脂培养基1瓶（约50mL）；0.2淀粉溶液1滴瓶、革氏碘液1滴瓶、310过氧化氢1滴瓶；2 菌种 枯草杆菌和大肠杆菌 其他来源的细菌 如土壤悬液3 仪器及其它试管4支、试管架1个、培养皿2套、接种环三 实验内容1 枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定2 细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验3 过氧化氢酶的定性测定四 方法步骤（一）枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定1 取4支干净的试管，按1、2、3对照编号。放在试管架上备用。2
15、在1、2、3号试管中分别加入5、10、15mL的枯草杆菌培养液，再在1、2号试管内分别加入10、5mL蒸馏水。在对照管内加入15mL蒸馏水。3 1、2、3号试管中分别加入0.2淀粉溶液若干滴，迅速摇匀并记下反应的初始时间。4 在以上4个试管内分别滴加若干滴碘液，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。5 观察结果。注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失的时间，并对结果进行分析。（二）细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验1 将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45左右倒入无菌培养皿内（每皿约10mL），共倒5个，静置待冷凝即成平板。2 在无菌操作条件下，所有的平板在培养皿底部贴好标签后，用接种环分别挑取枯草杆
16、菌和大肠杆菌分别在2个平板上点5个点。再打开一个平板，在空气中放置30分钟，盖上培养皿盖，剩余的两个平板处理如下：一个接种土壤悬液，另一个让学生用手在平板里氨手印，或取硬币在平板里按一下，或打开培养皿盖，摇摇头等，所有平板倒置于37恒温培养箱内培养24-48小时。3 观察结果，取出平板，分别在2个平板内菌落周围滴加碘液，观察菌落周围颜色的变化。并记录结果。（三）过氧化氢酶的定性测定1 将配备的枯草杆菌和大肠杆菌斜面各1支放在试管架上。2 用滴管吸取过氧化氢滴加入两管菌种斜面上。3 分析结果，把所观察到的现象记录下来，进行分析。五 结果与思考表一 枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定结果记录与分析试管蓝
17、色消失时间结果分析对照管1号2号3号表二 细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验结果记录与分析培养皿菌种淀粉酶产生情况结果分析1号2号注：产生记为阳性“+”，不产生记为阴性“”。表三 过氧化氢酶的定性测定结果记录与分析试管菌种过氧化氢酶有无结果分析1号2号注：有记为阳性“+”，无记为阴性“”。讲解注意事项：1、 对实验结果的讲解要与理论相结合，要告诉学生为什么会有这种现象发生。2、 让学生对酶的理解进一步加深。启发学生思考淀粉酶是胞内酶还是胞外酶，理解不是所有的细菌都能利用淀粉。注意对实验现象的引申。3、 关于过氧化氢酶，要让学生思考并理解为什么两个菌都是过氧化氢酶阳性。实验七 培养基的配制和灭菌
18、一 实验目的1 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2 掌握培养基和无菌水的制备方法。3 掌握高压蒸汽灭菌技术。二 实验器材1 药品及试剂：可溶性淀粉 KNO3 K2HPO43H2O MgSO47H2O FeSO47H2O 1mol/L NaOH 琼脂2 仪器及其它试管 三角瓶 烧杯 量筒 玻棒 天平 药匙 高压蒸汽灭菌锅 pH试纸(5.5-9.0) 棉花 牛皮纸 记号笔 麻绳 纱布 干燥箱 培养皿 涂布棒 吸管（1ml） 玻璃珠三 实验内容1 分组配制高氏一号培养基300ml。配方：可溶性淀粉 20g NaCL 0.5g KNO3 1g K2HPO43H2O 0.5g MgSO4*7H2O
19、 0.5g FeSO4*7H2O 0.01g 琼脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62 每组制备玻璃珠无菌水(50ml)三角瓶2个。3 每组制备无菌水试管(4.5ml/管)10支。4 每组包9cm培养皿24付，6付一包。5 每组包装1ml吸管5支，玻璃刮铲4个。四 方法步骤（一）培养基的制备与分装1 称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。2 熔化：在沸水浴锅中加热熔化。3 调pH：用1N NaOH调pH至7.4-7.6。4 过滤：趁热用多层纱布过滤（本实验勿需过滤）5 分装：将溶化的固体培养基趁热
20、加至漏斗上，装试管时，装量不超过试管的1/4，注意管口不要沾上培养基。6 加棉塞：试管应先捆成一捆，然后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。（二）无菌水的制备7 用量筒量取50ml自来水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。8 用5ml吸管取4.5ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（三）器皿的准备9 培养皿的包装 每6套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里加盖扣严）。10 吸管的包装 首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。11 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。（四）培养基、无菌水、器皿的灭菌12 将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌
21、。13 灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。14 器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。五 思考题1 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？2 加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？3 干热灭菌应该注意哪些事项？4 管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么？六、讲解注意事项1、提问学生什么是培养基，培养基配好后，为什么必须立即灭菌告诉学生如何检查灭菌后的培养菌是无菌的。2、讲解灭菌的机理以及适应干热灭菌和适宜湿热灭菌的物品3、强调灭菌时的注意事项实验八 细菌纯种分离、培养和接种技术一 实验目的1 掌握从环
22、境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯种培养技能。2 掌握几种接种技术。二 实验器材1 无菌培养皿10套、无菌移液管1mL2支、10mL1支2 营养琼脂培养基1瓶、土壤10克、湖水1瓶、无菌稀释水90mL、9mL的5管三 实验内容（一）细菌纯种分离的操作方法1 稀释平板分离法2 平板划线分离法（二）几种接种操作技术1 斜面接种技术2 穿刺接种技术3 稀释平板涂布法四 方法步骤（一）细菌纯种分离的操作方法1 稀释平板分离法1）取样用无菌锥形瓶到现场取一定量的土壤、湖水迅速带回实验室。2）稀释水样用无菌移液管取好梯度稀释水样。3）平板的制作用无菌移液管将
23、各稀释水样加入各融化的培养基内，制成稀释平板。2 平板划线分离法1）平板的制作将融化的培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。2）操作只取一次样，按不同方法进行划线。（二）几种接种操作技术1 斜面接种技术将长在斜面培养基（或平板培养基）上的微生物接到另一支斜面培养基上。2 穿刺接种技术将斜面菌种接种到半固体深层培养基。3 稀释平板涂布法把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落。五 思考题1 用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？六、讲解时的注意事项1、让学生明白为什么在菌种分离时要做稀释。2、让学生明白理解并掌握什么是倒平板，什么是稀释平板分离法，什么是平板画线
24、分离法，什么是稀释平板涂布法等经典的微生物分离的方法。3、理论联系实际，启发学生用所学的分离细菌的方法设计一个分离具有某种功能的细菌。让学生理解选择性压力法分离细菌的作用，富集培养基的应用等。实验九 纯培养菌种的菌体、菌落形态的观察一 实验目的观察上一实验分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。通过观察比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。二 实验器材1 显微镜、载玻片、接种环、酒精灯2 上一实验培养出的各种细菌，实验室配给放线菌、酵母菌及霉菌3 革兰氏染色液一套三 实验内容与方法（一）细菌菌落形态和菌体染色及其形态观察1 接种斜面培养基2 菌落
25、形态特征观察（二）细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征的比较四 思考题1 你分离培养出几种细菌，其菌落形态和个体形态是怎样的，革兰氏染色呈什么反应？2 通过本次实验你认识了几种微生物，从辩认菌落形态你能说出是哪一类微生物吗？五、讲解时的注意事项：启发学生思考如何才能获得微生物的纯培养、让学生理解明白菌落形态和微生物的个体形态是微生物的分类依据之一。实验十 卫生细菌的检验（乙） 细菌菌落总数（CFU）的测定一 实验原理细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合它们的培养基才能将它们培养出来。然而在实验工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机污染程
26、度。二 实验器材1 无菌培养皿10套、无菌移液管1mL2支、10mL1支2 营养琼脂培养基1瓶、土壤10克、湖水1瓶、无菌稀释水90mL、9mL的5管三 实验内容与操作方法（一）生活饮用水（二）水源水1 稀释水样2 接种3 计菌落数四 菌落计数及报告方法用肉眼观察，计平板上的细菌菌落总数。记下同一浓度的三个平板的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即1mL水样中细菌菌落总数。共有七种不同情况的计算方法。五 思考题1 测定水中大肠菌群数有什么实际意义？为什么选用大肠菌群作为水的卫生指标？2 测定水中菌落总数有什么实际意义？3 根据我国饮用水水质标准，讨论你这次检验结果？六、讲解时注意事项：1、让学生理解并掌握该方法。即为什么稀释平板法可以用于微生物计数，计数结果是否正确，是偏小还是偏大，与显微镜直接计数法相比有什么不同。2、启发学生设计一个检验某种能杀菌的物理或化学方法的杀菌效率的实验的实验思路。3、介绍我国现行生活饮用水的卫生标准及大肠杆菌群的多管发酵法，告诉学生此为选做实验。
