1、二价金属离子对磷脂聚集态的影响二价金属离子对磷脂聚集态的影响The influence of divalent metal ions on the aggregation properties of EYPC化学与分子工程学院2000级 俞科兵College of chemistry and molecular engineering Yu Kebing摘要主要通过浊度分析和激光光散射光谱研究了二价金属离子（Ca2、Cu2、Zn2+和Mn2）对卵磷脂(EYPC)聚集态的影响。结果表明：自由的二价金属离子对EYPC囊泡有破坏作用，并使EYPC囊泡发生相转变，形成胶束；而与胆汁酸钠(NaTC，Na
2、GC，NaTDC，NaDC)结合的二价金属离子使EYPC囊泡半径减小，但不破坏EYPC囊泡。关键词: 卵磷脂，二价金属离子，胆盐，聚集态，紫外分析AbstractThe methods of light scattering and UV spectroscopy are applied to follow the effects of divalent metal ions on EYPC vesicles. We conclude free divalent metal ions act to precipitate unilamellar PC vesicles whereas, in
3、combination with sodium taurocholate, sodium glycocholate, sodium deoxycholate or sodium deoxytaurocholate, these ions act to decrease the size of PC vesicles and some induce a phase transition from PC vesicles to mixed micelles. Keywords: phosphatidylcholine, divalent metal ions, bile salts, aggreg
4、ation properties, UV-vis1前言1.1 胆汁酸胆汁酸是胆汁中存在的一大类胆烷酸的总称，人体中由胆固醇合成而来。胆酸可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。初级胆汁酸主要为胆酸和鹅脱氧胆酸，二者在结构上区别为胆酸含三个羟基（3,7,12）而鹅脱氧胆酸为两个羟基（3，7）。初级胆汁酸羧基侧链与其他分子结合后生成初级结合胆汁酸，比如牛磺胆酸，甘氨胆酸等。初级胆汁酸失去一个7-羟基后生成次级胆汁酸，如脱氧胆酸，脱氧牛磺胆酸等。1.2 磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱也称为卵磷脂(phosphatidylcholine PC，结构见图1)，系统名称为1,2二酰基sn甘油3磷酸胆碱(1,2-diacyl-
5、sn-glycero-3-phosphocholine)。在磷脂结构中，1,2位羟基上接的是长链的非极性基团，称为尾部。而3位羟基上接的是极性的磷酸胆碱，称为头部。当磷脂溶于水溶液中时，其极性部位指向水相而非极性部位由于不溶于水而聚集在一起形成中间疏水区，外边亲水的磷脂聚集体，而具体的结构根据磷脂浓度的不同有所差异。当PC浓度小于cmc (critical micelle concentration) 时，磷脂形成单层的膜结构；当PC浓度大于cmc但小于cvc (critical vesicle concentration) 时，磷脂形成球状胶束或棒状胶束；当PC浓度大于cvc时，磷脂将形成双
6、层囊泡或多层囊泡。在胆囊里这些不同结构的磷脂完成了胆固醇的溶解和转运。 图1 EYPC的分子结构图Fig.1 The structure of EYPC1.3 研究背景在胆汁中90以上的磷脂为卵磷脂，并与胆盐和胆固醇形成混合囊泡或胶团，实现溶解和排泄胆固醇的生理功能，其中胆盐起增溶磷脂的作用，一旦这一过程发生异常将导致胆固醇的析出，形成结石。因此，有关胆盐和磷脂间相互作用以及由此引起磷脂相转变的研究已有相当多的报道。Catharina P. Nibbering等1的研究表明，EYPC/TC比值改变时，胶团的平均水化动力学半径(Rh)发生变化。EYPC含量增加，Rh增加；TC含量增加，Rh降低。
7、并且稀释EYPC/NaTC溶液可以使胶束(micelles)转化为囊泡(vesicles)。胆汁中除含有大量上述有机物外，还含有大量金属离子，其中包括相当含量的二价金属离子，如：Ca2、Cu2、Mn2+等。近几年的研究2-6表明金属离子与胆盐作用将改变其胶化性质，从而影响其生物功能。我们的研究结果表明7，二价金属离子能够通过配位与胆盐作用，改变胆盐的聚集状态。但相关的二价金属离子与卵磷脂作用改变其聚集状态，尤其是对胆盐/卵磷脂混合胶团聚集态的影响尚未见报道。在本文中，我们通过浊度、激光光散射、透射电镜分析研究了二价金属离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+)在胆盐(TC,GC,TDC)存
8、在的环境中与卵磷脂作用改变其胶团的聚集状态，为研究胆固醇结石的形成机理提供依据。2实验部分2.1 试剂胆汁酸钠(TC,TDC,DC)为Sigma公司生化试剂，纯度大于97%；蛋黄卵磷脂(EYPC)为北京百泰生化技术公司生化试剂。CaCl2、CuCl2、MnCl2、ZnCl2、NaCl均为分析纯试剂。2.2 卵磷脂囊泡的制备 将一定量的EYPC溶解于氯仿中，在N2气氛下自然干燥后，置于真空干燥器中干燥12小时。将得到的固体EYPC用二次重蒸水溶解，经透射电子显微镜观察，证实得到是EYPC的囊泡溶液，浓度为2gdm-3。2.3 卵磷脂/牛磺胆酸盐混合体系的制备将一定量的EYPC溶解于氯仿中，再将一
9、系列量的TC溶解于甲醇中，混合后在N2气氛下自然干燥，置于真空干燥器中干燥12小时，将得到的固体用二次重蒸水溶解，然后超声6小时，得到不同比例的EYPC/TC混合溶液，其中EYPC的浓度均为2gdm-3。2.4 卵磷脂/胆固醇混合体系的制备将一定量EYPC溶解于氯仿中，再加一定量的胆固醇(chol)溶于其中，其中一部分加入一定量牛磺胆酸钠，分别在N2气氛下自然干燥，真空干燥12小时，将得到的固体用二次重蒸水溶解并超声6小时，得到两份溶液。其一为卵磷脂和胆固醇的混合体系，其中两者比例为2:1；其二为卵磷脂、胆固醇、牛磺胆酸钠的混合体系，三者比例为2:1:6。EYPC的浓度均为2 gdm-3。2.
10、5 浊度测定将cTC=0.2moldm-3的TC与cM2+=1.0 moldm-3（M2+=Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+）溶液混合，制成M2+/TC摩尔比不同的混合溶液。将M2+，TC，M2+/TC混合溶液滴加到上述EYPC溶液中，充分作用后用Shimado UV-3100型的UV-Vis光谱仪在500nm下测定其吸光度的变化。2.6 激光光散射(QLS) 用ALV/DLS/SLS 5722F QLS光谱仪测量EYPC囊泡溶液、EYPC/TC及EYPC/TC/M2+混合溶液中平均水化动力学半径(Rh)。激光光源采用氩离子激光，波长632.8 nm；散射角90o。所有样品经12,000
11、g离心30 min，在25 oC水浴中恒温15min后进行测试。3结果及讨论3.1 金属离子与EYPC的相互作用图2. 2gdm-3 EYPC溶液的TEM照片Fig.2 the TEM photo of EYPC aqueous solution (2 gdm-3) 图2是2 gdm-3 EYPC溶液的电镜照片。从图中可见，在溶液中磷脂的存在方式一般为多层囊泡的结构，在加入金属离子后，金属离子将会诱导磷脂囊泡向胶束结构的转变。这个变化反映在溶液的物化性质上表现为溶液浊度的变化。图3为EYPC溶液中加入1 moldm-3的金属离子溶液后体系的浊度变化曲线。当体系里加入一价金属离子Na+时，体系浊
12、度变化不大，且Na+达到一定浓度时，吸光度不再发生变化。而当体系中加入二价金属离子(Ca2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+)时，体系的浊度随着金属离子的加入而急剧增大，并且在金属离子浓度约为0.03 moldm-3时趋于恒定。FTIR的结果表明沉淀为EYPC。由此可见二价金属离子在较低的浓度下即可破坏EYPC的囊泡结构，降低其溶解度使之析出沉淀；而不同二价离子的作用能力有点差异，原因在于它们之间不同的电子结构使得它们在配位性能及电性上有差异。图3. EYPC囊泡溶液中加入Mn+后体系浊度的变化 (图中H2O作为参比)Fig.3 The changes of turbidity of th
13、e EYPC aqueous solution by adding Mn+3.2 胆盐和EYPC的相互作用图4. EYPC溶液加入不同胆盐后体系浊度的变化Fig.4 The changes of turbidity of EYPC aqueous solution by adding bile salts由于在囊泡向胶束、或胶束向囊泡的转变过程中，EYPC将失去其囊泡结构（直径约为200nm左右），形成胶束结构（直径约为5nm左右）；或失去胶束结构，形成囊泡结构。在这个一破一立的过程中，EYPC的溶解度将发生很大的改变。因此观测溶液浊度变化可以捕捉EYPC相转变及聚集态变化的信息1。在图4中，
14、随着各种胆盐的加入，体系的浊度缓缓降低，但没有观察到体系的浊度出现峰值，表明其中并没有发生由囊泡向胶束的相转变过程。从激光光散射的分析结果可以看到（见表1），加入TC（c=0.02moldm-3）后，体系的Rh值从201nm降为67nm，意味着加入TC使EYPC囊泡的半径减少，与文献报道一致1。表1 不同体系中聚集态的水化动力学半径 (Rh)Table 1 The changes of hydrodynamic radius (Rh) in different systems (the concentration of TC is 0.02 moldm-3)SystemEYPCEYPC+TCE
15、YPC+TC/Ca(1:1)EYPC+TC/Ca（1:5）Rh(nm)20167472.7* Rh: means of at least three measurements各种不同胆盐的变化趋势能明显的分成两类：DC, TDC和C, TC, GC。这恰与胆盐自身的性质一致。DC, TDC为两羟基胆盐，C, TC, GC为三羟基胆盐，在结构上有一个羟基的差异，这说明在胆盐和EYPC的作用过程中，羟基参与了与EYPC的反应，并且不同数目的羟基有相异的作用效果。在形成复合囊泡的过程中，胆盐的甾环平面改变了囊泡中EYPC层的曲率，从而分化成半径较小的囊泡。3.3 TC,金属离子混合溶液与EYPC的相
16、互作用图5. EYPC溶液加入TC/Mn+ 后体系浊度的变化Fig.5 The changes of turbidity of EYPC aqueous solution by adding TC and Mn+ mixtures(The molar ratio of TC to Mn+ is 1:5) 我们以前的研究结果表明，二价金属离子在溶液中能够与胆盐发生配位作用使胆盐的聚集状态发生改变。将TC/M2+摩尔比为1:5（M2+的浓度远远大于TC的浓度）的混合溶液滴入EYPC囊泡溶液后，体系的浊度曲线出现峰值（见图5），浊度峰值出现在TC浓度约0.006 moldm-3及Mn+浓度约0.03
17、 moldm-3处，并且对于不同的二价金属离子浊度峰值出现的位置有细微的差别，Mn2+体系出现得早一些，而Ca2+和Cu2+的体系则晚一点，Zn2+体系出现得最晚。加入金属离子后体系浊度的最大值依次为：Mn2+Cu2+Ca2+Zn2+，而一价金属离子Na+则不出现浊度峰值。浊度峰值的出现意味着随着TC/M2+的加入，体系出现了聚集态结构的变化。当体系浊度达到最大值时，FTIR的结果表明，体系中出现的沉淀为EYPC。继续增加TC/M2+至0.016 moldm-3/0.08 moldm-3，体系澄清，吸光度甚至低于原始值。激光光散射分析的结果表明（见表1），当TC/Ca2+的浓度加到0.018
18、moldm-3/0.09 moldm-3时，Rh值由原始的201nm变为2.7nm 。说明随着TC/M2+的加入，体系中发生了从囊泡向胶束的聚集态相转变。也就是说，当TC/M2+达到一定浓度（0.006 moldm-3/0.03 moldm-3）时，体系原有的聚集态结构被破坏；随着TC/M2+的继续增加，体系中形成了新的聚集态结构。图6. EYPC囊泡溶液中加入TC/Mn+ (1:1)后体系浊度的变化Fig.6 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding taurocholate (TC) and Mn+ mi
19、xtures (the molar ratio of TC to Mn+ is 1:1)将TC/Mn+的浓度比改为1:1，从图6可以看到，对于Na体系与TC/Mn+的浓度比为1:5的相比具有相同的变化趋势；而对于M2+体系，随着TC/M2+浓度的增加，体系的浊度曲线没有出现峰值，而是先降低，而后出现一个平台，然后又降低，最终降低到一定值后，溶液澄清，浊度不再下降，在整个实验范围内，体系浊度一直没有增加，EYPC的囊泡结构没有被破坏，也没有发生由囊泡向胶束的转换。反而随着TC/M2+的加入，体系的浊度逐渐减小。由于在溶液里TC-和M2+形成MTC+的配合物，因此可以认为当M2+浓度等于TC时，溶
20、液中M2+基本以结合的形式存在。由此可见，与TC结合的结合态M2+对EYPC囊泡没有破坏作用，而且由于TC与EYPC形成混合结构使得EYPC在水中的溶解度增加，因而体系的浊度降低。而激光光散射的分析结果亦表明（表1），当TC/Ca2+的浓度为0.02moldm-3/0.02 moldm-3，体系为澄清态时，聚集态粒子的Rh为47nm。说明在EYPC的囊泡溶液中加入浓度比为1:1的TC/M2+溶液后，体系没有相转变过程发生。由此可见，对于不同比例的TC/M2+, EYPC的变化过程有很大区别。从图7,8,9,10中可以看出，不同金属离子和TC所形成的混合溶液对EYPC结构的影响有差异，引起EYP
21、C相变化的M2+/TC比例有区别。对于Ca2+/TC和Cu2+/TC，能引起EYPC相变的最小比例为2:13:1之间；而Mn2+/TC能引起EYPC的最小比例为1:12:1之间；对于Zn2+/TC，其比例在3:15:1。对于小于此比例的M2+/TC混合溶液不能引发EYPC体系的相变。由此说明即使同一价态不同金属对磷脂体系的作用还是有区别，因此两者作用方式不仅是电价作用，而且还存在配位作用。图7. EYPC溶液中加入不同浓度比例的Ca2+/TC后体系的变化Fig.7 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding C
22、a2+ and TC mixture图8. EYPC溶液中加入不同浓度比例的Cu2+/TC后体系的变化Fig.8 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding Cu2+ and TC mixture图9. EYPC溶液中加入不同浓度比例的Mn2+/TC后体系的变化Fig.9 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding Mn2+ and TC mixture图10. EYPC溶液中加入不同浓度比例的Zn2+/TC后体系的变化Fig.
23、10 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding Zn2+ and TC mixture3.4 不同胆盐，Ca2+混合溶液与EYPC的作用规律图11. EYPC溶液中加入不同种类胆盐与Ca2+离子混合溶液后的浊度变化 (BS:Ca2+=1:5)Fig.11 The changes of turbidity of the EYPC aqueous solution by adding bile salt and Ca2+ mixture从图11可以看出，作为三羟基胆盐的GC和TC有相似的变化规律，而与二羟基胆盐T
24、DC有明显的不同。GC,TC与Ca2+形成的混合溶液(1:5)均能使EYPC发生相转变，相反加入1:5的TDC/Ca2+至EYPC中后，体系的浊度逐渐由0.35降低到0.1，过程中不出现浊度峰，说明体系并没有发生相转变。这与图4的结果一致。进一步证明在胆盐和EYPC的作用过程中，胆盐上起决定作用的基团是甾环平面，上面的羟基处于一个重要的位置，直接影响与EYPC的作用位点；而胆酸衍生部分即末端羧基结合基团的性质对于胆盐与EYPC相互作用的结果影响不太大。 图12. TC的立体结构 图13. TDC的立体结构Fig.12 The stereo structure of Fig. 13 The st
25、ereo structure of steroid rings of TC steroid rings of TDC 3.5 EYPC,TC混合溶液与锰离子的相互作用表2 不同EYPC,TC比例溶液的水化动力学半径分布曲线的峰值分布EYPC/TC=1/3EYPC/TC=1/1EYPC/TC=3/1EYPC/TC=5/1峰值/nm6.7642.38.1766.18.6078.49.7031.1相对高度10.710.4710.0510.271在不同相对比例的EYPC,TC配比制备的溶液中，EYPC有不同聚集状态。表2中给出的激光光散射数据指明了不同配比的EYPC/TC溶液有不同的粒径分布。文献报道
26、22-23当磷脂与较低浓度胆盐(1/2时，主要形成双层盘状胶束；当磷脂/胆盐1/2时，主要生成均匀的球状胶团。而不同的磷脂结构对金属离子的作用结果有所差异。图14. EYPC,TC混合溶液中加入Mn2+后体系浊度的变化Fig.14 Change of turbidity of the EYPC and TC mixture by adding Mn2+图14反映了Mn2+加入至不同EYPC/TC配比的溶液后体系浊度的变化规律。从图中可以看出，对于EYPC/TC为5:1, 3:1的溶液，由于磷脂囊泡为主要结构，在Mn2+的作用下囊泡被破坏形成沉淀而使体系浊度急剧增加。EYPC/TC为1:1时，体
27、系中主要是双层盘状胶束，这种结构对Mn2+离子有比较好的抵抗作用，因此在加入Mn2+的过程中，体系的浊度并不发生很大变化。EYPC/TC为1:3时，体系中主要为球状胶团，而胶团结构对Mn2+的抵抗能力较弱，因此加入Mn2+后，胶团被聚集形成沉淀，体系的浊度快速上升。而对于EYPC/TC为1:5的溶液，由于体系中游离着很多的自由TC，可以与加入了的Mn2+发生配位络合，而结合态的金属离子对磷脂没有破坏作用，所以浊度曲线表现为一条平直的曲线。因此EYPC/TC为1:1或1:5左右的溶液比较稳定，能够抑制自由Mn2+的破坏作用。图6中从c(TC)为4 mmoldm-3开始的一个缓冲平台也说明此时形成
28、了一种相对稳定的聚集体 （此时EYPC/TC为0.6）。EYPC和TC的混合囊泡在胆囊里作为胆固醇的主要载体，能起增溶胆固醇的作用，但是在加入自由的金属离子以后，磷脂囊泡被破坏，溶解的胆固醇析出，最后将形成胆结石。3.6 M2+与EYPC,胆固醇混合体系的相互作用图15. EYPC,胆固醇混合体系中加入M2+后体系浊度变化Fig.15 The changes of turbidity of the EYPC and chol mixture by adding M2+图16. EYPC,TC,胆固醇混合体系中加入M2+后体系浊度变化Fig.16 The changes of turbidity
29、 of the EYPC,TC and chol mixture by adding M2+磷脂在生理上的其中一个作用是溶解胆固醇，防止在胆囊里发生由于胆固醇的沉淀而引起的胆结石病症。图15和图16表示在混合体系中加入各种金属离子时体系浊度的变化情况。通常金属离子和磷脂囊泡作用有两种情形：金属离子破坏PC囊泡并使之形成沉淀或是金属离子融合PC囊泡形成更大的多层囊泡。图15中Ca2+,Cu2+形成的浊度曲线比较一致而与Mn2+的曲线有较大区别。加入此三种金属离子后体系浊度升高，说明与PC囊泡的作用方式均以破坏囊泡为主，而继续加入Mn2+后，体系浊度反而有点降低，说明Mn2+有一定的融合囊泡的能力
30、，形成更大的多层囊泡，增加了磷脂对胆固醇的溶解能力，所以体系浊度会有所降低。这一点和某些稀土离子的行为比较相似。图16的结果与图15类似：加入金属离子后，磷脂、胆盐的混合胶团被破坏，溶解在里面的胆固醇和磷脂一起被沉淀出来，使浊度上升。当金属离子浓度0.04moldm-3附近时，体系浊度达到最大 4结论自由的二价金属离子对EYPC囊泡的破坏作用远远大于Na+，这种破坏作用是产生EYPC相转变（从磷脂到囊泡）的动力；与TC结合的M2+对EYPC没有破坏作用，也不能使囊泡发生相转变；适当比例的EYPC/TC混合囊泡是一种比较稳定的存在，能够抑制自由Ca2+的破坏作用。在胆盐和磷脂的作用过程中，胆盐上
31、的作用位点为它的甾环平面，其结构对于两者的相互作用效果起了很大影响。致 谢首先应当感谢李政道先生和已故的秦惠 女士，正是他们热心的资助，才使我提前走入实验室，享受发现的快乐。实验室的具体工作是在杨展澜副教授的指导下完成的。每次与杨老师讨论实验进展，设计实验方案，分析试验结果时都能得到她的精心指导，使我受益匪浅。这篇论文的完成，同样凝结着她的心血，在这里，同样向她致以最最诚挚的谢意。在此期间本实验室的老师和同学为我的学习和工作提供了许多便利，与他们的讨论常常是我思想的源泉。在此向他们表达我深深的谢意。最后，向生我、养我，永远给我以莫大关怀的父母致以最诚挚的感谢，他们所给予我的，是我永远无法报答的。参 考 文 献1. Catharina P. Nibbering, Peter M. Frederik, Gerard P. van Berge-Henegouwen, Henk A. van Veen, Jan van Marle, Karel J. van Erpecum, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1583: 2132. Liu ZJ, Wu JG, Zhao W, Wu PQ, Soloway RD, Xu GX. Acta Scienti
