1、色谱分析,第二章色谱法基本原理,利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数（或吸附系数等），当两相做相对运动时，这些物质将在两相中发生反复多次的分配(或吸附)，致使那些分配系数（或吸附系数)只有微小差异的组分也能产生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离。,分配系数、分配比,分配比:在一定的温度、压力下，组分在两相间达平衡时，在固定相与流动相中分配的质量之比。即,色谱峰及其描述参数,峰高h峰面积 A=1.065Y1/2h Y1/2为半峰宽,时间表示保留值,死 时 间 tM 不被固定相吸附或溶解的气体从进 样开始到柱后出现响应信号极大 值色谱峰及其描述参数所需的时间。保留时间
2、tR 组分从进样开始到柱后出现该组分 响应信号极大值所需的时间。校正保留时间 tR 扣除死时间后组分的保留时间。实 质上为组分在固定相中停留的时间 tR=tR tM,定义：组分2的校正保留值与组分1的校正保留值之 比,是一个无因次量，一般大于1.r2,1 只和柱温和固定相性质有关，而与柱径，柱长，填充情况及流动相流速无关，是色谱法中广泛使用的定性指标。,相对保留值 r 2,1,相对保留值r2，1（即分离因子）表示色谱柱选择性的好坏,塔板理论模型：色谱柱由若干块塔板组成的分馏塔。在每一塔板内，一部分空间为固定相所占据，另一部分空间则为流动相所占据，流动相占据的空间称为板体积。待分离组分随流动相进
3、入色谱柱后，在每块塔板里的两相间达成一次分配平衡（在柱内每达成一次分配平衡所需要的柱长就叫做塔板高度H）。经过这样多次分配平衡之后，分配系数不同的组分彼此分离，分配系数小者最先从塔顶逸出。,塔 板 理 论,由Y1/22.354 和Y4可证明,由于死时间 tM（VM）的存在，它又包括在 tR（VR）中，而 tM（VM）并不参加色谱柱内的分配，故理论塔板数 n理和理论塔板高度H理并不能真实反映出色谱柱分离效果的好坏。为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数 n有效和有效塔板高度 H有效,有效塔板数和有效塔板高度,第三章气 相 色 谱 法,分离原理：当待测各组分随载气进入色谱柱后，气相中的待测组分立
4、即吸附溶解到固定相中去。载气连续不断的流经色谱柱时，固定相中的待测组分又经脱附挥发回到气相中去。随着载气的流动，脱附挥发到气相中的待测组分又吸附溶解到前面的固定液中。由于各组分在固定相中的溶解、挥发能力不同，在反复多次的吸附脱附、溶解挥发过程中，溶解度大的组分在柱中停留的时间长，向前移动慢；溶解度小的组分在柱中停留的时间短，向前移动快 经过一定时间待测物质中的各个组分就彼此分离,先后流出色谱柱。,先根据样品沸程选择温度范围适宜的固定液，然后根据“相似互溶”原则，即固定液的性质和待测组分的性质有某些相似时，其溶解度就大，分配系数也大，选择性就高。通常可按下述六点来选择固定液：1 分离非极性物质，
5、一般选用非极性固定液，此时试样中各组分按沸点顺序先后流出色谱柱沸点低的先流出，沸点高的后流出。2 分离极性物质，一般选用极性固定液此时试样中各组分主要按极性顺序分离，极性小的先流出，极性大的后流出。,固定液选择的总原则,分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液。此时非极性组分先流出，极性组分后流出。4 对于能形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等的分离，一般选极性的或氢键型固定液，此时试样中各组分按与固定液分子间形成氢键的能力大小先后流出。不易形成氧键的先流出，最易形成氢键的后流出。5 对于复杂的难分离的物质，可以用两种以上的混合固定液。,3.3.3 色谱柱的老化,目的：去除残留的溶剂（涂固定
6、相时引入）及其它有机物，促进柱内固定液以及固 定相均匀分布，提高柱效。操作条件1.色谱柱放空（即不接通检测器）2.通载气min3.柱温高于工作温度,低于固定 液最高使用温度4.加热h,浓度型检测器 测量的是载气中某组分浓度的瞬间变化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比.RC;R=ScC例如：热导池检测器电子捕获检测器,检测器,质量型检测器 测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化,即检测器的响应值和单位时间内进入检测器的某组分的量成正比.R m;R=Sm(dm/dt)例如:氢火焰离子化检测器 火焰光度检测器,气相色谱的定性分析方法,一.保留值定性 单柱直接对照 双柱 峰高加入法二.保留值的经验
7、规律定性 三.保留指数定性 四.与其它仪器分析方法结合定性,二.利用保留值的经验规律定性,1.同系物,2.同碳数的同族化合物(异构体),三.利用保留指数定性,一定操作条件下，组分 i 的重量（mi）摩尔数（Mi）或体积（Vi）与检测器的响应信号（谱图的峰面积 Ai 或峰高 hi）成正比峰面积在定量分析中准确度好，常用于定量分析 定量分析要求：准确测定峰面积 Ai 准确求出比例常数 f i（定量校正因子）正确选用定量方法，把测得的峰面积 换算为百分含量,3.气相色谱定量分析,最好有色谱纯试剂，如没有纯品，要确知该物质的百 分含量。测定时先准确称量标准物和待测物，再将它 们混合均匀进样，测出它们的
8、峰面积，按下式计算：,2.校正因子的测定,1.标准曲线法（外标法）又叫定量进样 标准曲线法：将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液（液体样品用溶剂稀释，气体样品用载气稀释）然后取固定量的标准溶液进行分析，从所得色谱 图上测出峰面积和峰高，然后绘制响应信号（纵 坐标）对浓度（横坐标）的标准曲线。,分析样品时，取与制标准曲线同量的试样（定量进样），测得该试样的响应信号，由标准曲线 查其浓度。,2.内标法当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时，可采用此法。内标法：将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据待测物和内标物的重量及其在色谱图上相应的峰面积比，求出某组分
9、的含量。例如，要测定试样中组分（重量为m）的百分含量m%时，可于试样中加入重量为mr的内标物r，试样重为m，则,以内标物为基准，则s=1，计算可简化为 内标法优点：定量准确缺点：每次分析都要称取样品和内标物的重量，不适于作快速控制分析。,标准为别人，注意mi、mr、m三者的区别,3 归一化法 当试样中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显 示色谱峰时，可用此法进行定量计算。设试样中有n 个组分，各组分的量分别为m1，m2，mn，各组分含量的总和 m 为100，其中组分 的百分含量m%可按下式计,基础:经典液相色谱法高压泵，高效固定相，高灵敏度检测器高效分离、快速、自动分析理论:气相色谱法,第四章
10、 高效液相色谱法(HPLC),GC分析速度快、柱子长、柱效和灵敏度高、便宜。流动相廉价无毒，对分离基本不起作用，故一般不用更换流动相，而只换柱子，但流动相不能回收只能分析热稳定性好、分子量小于400、沸点低于500的组分。可分析的化合物很有限（15 0）检测器种类有限。HPLC分析对象广，几乎所有化合物都能分析。可用的检测器种类很多。流动相对分离起很大作用检测时，一般不更换柱子，而是广泛改变流动相的组成或比例流动相可回收,HPLC与GC相比,HPLC 经典液相色谱柱寿命：可用12年 仅用1次分析时间：XX0 min XX0 hr 在线检测 离线检测进样量：XX0 l XX0 ml柱效和工作压低
11、高,HPLC与经典液相色谱法相比,化学键合固定相的优点：传质速度快。固定液不会流失，增加色谱柱稳定性和使用寿命。可键合不同官能团，可灵活地改变选择性。利于梯度洗提，利于配用灵敏的检测器和 收集所需的馏分。液液分配色谱常用的固定液：如氧二丙晴、聚乙二醇、聚酰胺、三甲撑乙二醇、氢乙基硅酮、正十八烷和角鲨烷等。,1色谱柱的柱效n由那些因素决定？如何提高柱效？,柱效影响因素：载气种类及性质、色谱柱填充物的直径及填充的均匀度、填充物表面液膜厚度和载气流速。提高柱效方法：使用颗粒均匀、粒度适当的担体，均匀填充，采用分子量大的载气，高流速低柱温分离，减小液膜厚度，增大组分在液相中扩散系数等。,第二章 色谱法
12、的基本原理,2.5 高效液相色谱法分离两个组分，色谱柱长为 30 cm。已知在实验条件下，色谱柱对组分2的柱效能为26800 m-1，死时间tM=1.50 min，组分的保留时间 tR1=4.15 min，tR2=4.55 min。计算：(a)两组分在固定相中的保留时间；(b)两个组分的分配比k1，k2；(c)选择性因子；(d)30 cm 长色谱柱的理论塔板数 n。,解：,(a),(b),(c),(d),2.20 在HPLC柱上分离药物制剂，甲醇水为流动相，药物A、B及甲醇的保留时间分别为2.0 min、5.0 min和1.0 min，甲醇的保留时间为死时间，计算：(a)药物B停留在固定相中的
13、时间是A的几倍？(b)药物B在流动相上消耗的时间是A的几倍？(c)药物B的分配系数是A的几倍？(d)药物B在柱中的线速度是A的几倍？,解：,(a),(b),(c),(d),2.22 在液相色谱分析中，含A，B和C三种组分的混合物在30 cm长的色谱柱上分离，测得不保留组分A的出峰时间是1.3 min，组分B和C的保留时间分别是16.40 min和17.36 min，峰底宽分别为1.11 min和1.21 min。计算：(a)组分A和B的分离度；(b)色谱柱的平均理论塔板数和理论塔板高度；(c)若使组分A和B的分离度达到1.5，假设理论塔板高度不变，需要多长的色谱柱？(d)使用较长色谱柱后，组分
14、B的保留时间为多少(流动相线流速不变)？(e)如果仍使用30 cm长的色谱柱,要使分离度达到1.5，理论塔板高度为多少？,解：,(a),(b),(c),(d),第一种方法,第二种方法,(e),第一种方法,第二种方法,k2,13121,13141,0.0023cm,第三章 气相色谱法,3.14 采用内标法测定燕麦敌1号试样中燕麦敌含量时，称取燕麦敌试样18.2 g，加入正十八烷1.88 g，测得峰面积A燕麦敌=68.0 mV min，A正十八烷=87.0 mV min，已知燕麦敌以正十八烷为标准的相对校正因子为2.40，计算试样中燕麦敌含量？,解：,19.38%,3.11 气相色谱固定相为聚乙二
15、醇，当柱温为100时，把含有A和B的样品以及相隔两个碳的两种正构烷烃的混合物注入色谱柱分析，A在两种正构烷烃之间流出，它们的保留时间分别为10.62 min，12.62 min，14.82 min，测得甲烷的保留时间为0.62 min，最先流出的正构烷烃的保留指数为900，而组分B的保留指数为958.2，求组分A的保留指数，试问A和B有可能是同系物吗（提示：据题意n=9，m=2，计算保留指数时需用调整保留时间）？,解：,(a),(b),A和B不是同系物，因为45.79不是100的整数倍,3.18 用GC测定废水中的二甲苯，以苯为内标物，检测器为火焰离子化检测器。取 1 L废水(不含苯)，加入0
16、.5 mg苯，经二氯甲烷溶剂萃取和浓缩后，得到 1 mL样品。取 1 L进样分析，测定四个组分的峰面积如下表(fis是组分的相对校正因子)：请用内标法计算此废水样品中三种二甲苯异构体的物质的摩尔浓度。,解：,3.18 用GC测定废水中的二甲苯，以苯为内标物，检测器为火焰离子化检测器。取 1 L废水(不含苯)，加入0.5 mg苯，经二氯甲烷溶剂萃取和浓缩后，得到 1 mL样品。取 1 L进样分析，测定四个组分的峰面积如下表(fis是组分的相对校正因子)：请用内标法计算此废水样品中三种二甲苯异构体的物质的摩尔浓度。,解：,第四章 高效液相色谱法,4.11 利用HPLC内标法测定生物碱试样中黄连碱和
17、小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2500 g配置成混合溶液，测得峰面积分别为450.0，430.0和512.5 mVmin。称取0.3000 g内标物和0.5120 g试样，同法制成混合溶液后，在相同的色谱条件下，测得内标物、黄连碱和小檗碱的峰面积分别为520.0，462.5和567.5 mVmin，计算样品中黄连碱和小檗碱的百分含量。,解：,4.13 用高效液相色谱法分离两个组分，色谱柱长为15 cm，已知在实验条件下，色谱柱对组分2的理论塔板数为28000，死时间为1.30 min，两个组分的保留时间分别为4.15 min和4.50 min。求两个组分的分配比（k）及分离度（Rs）。若色谱柱长度增加到30 cm，分离度Rs应为多少？两组分能否完全分开？,解：,(a),(b),(c),可以完全分离,
