1、生物工程设备课程实验指导生物工程设备课程实验指导前言生物化工专业综合性大型实验是针对本专业四年级学生开设的一门独立设课的必修实验课，是专业实践性教学中重要一环。有以往各课程实验基础上，大型实验课将使学生获得科学实验的强化训练。受到多方面更加深入、较为完整的运用所学知识，进行实践和提高动手能力的综合性锻炼。使学生不仅有较扎实的理论知识，又有较强的分析问题和解决问题的实践能力，以适应国家对培养社会主义现代化建设人才的需要。大型实验课在内容上，把生物化学、微生物学、生物化工的专业理论与实践有机地、紧密地结合起来，成为对高年级学生进行较为全面、系统的综合训练的实验课。要求参加实验的学生，在教师的正确指
2、导下，经过预习准备，按实验要求，自己独立拟订实验实施方案，运用实验室条件进行操作，并写出具有一定水平的实验报告，使学生获得一次类似做科研论文的训练。大型实验课侧重于提高学生的实践能力，引导学生把所学知识和实验内容紧密地结合起来并用理论指导实践，解决实验中的问题。学生实验成绩评定，由实验操作技能、实验态度、实验报告与实验中分析问题和解决问题诸方面综合考核确定。其中实验态度与实验操作能力占50，实验报告质量与回答问题水平占50。第部分 高核糖核酸含量酵母的筛选及发酵试验（一）高核糖核酸含量的酵母的筛选简介核糖核酸是医药工业和食品工业调味剂的重要原科，关于微生物菌体内的含量。般细菌为0.35.1，酵
3、母为2.711，霉菌为0.72.8。工业上生产核糖核酸主要由酵母提取制备。核糖核酸得率取决于酵母中核糖核酸的含量，因此提高酵母核糖核酸含量，是工业生产核糖核酸的关键。一、菌种的活化及扩大培养（一）菌种与材料：菌种：丹麦啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌等培养基：麦芽汁培养基麦芽琼脂培养基器材：水浴锅、烧杯、比色盘、碘液、纱布、灭菌锅、漏斗、试管等。（二）方珐与步骤：流程：液体石蜡保藏菌种麦芽汁培养基活化（三天）麦芽琼脂固体培养基（一天）步骤：（）麦芽汁的制备：干麦芽首先进行压碎。加34倍水，浸泡1小时，然后升温至63糖化46小时，用150碘液测定为黄色至无色。用纱布过滤，可以反夏回流，直到滤液透明澄清
4、为止，即为麦芽汁。分装后1公斤厘米2蒸汽灭菌15分钟备用。（）固体斜面麦芽培养基的制备：用12巴林的麦芽汁加2琼脂加热使溶解，然后分装于试管中（约装四分之一），放在灭菌釜中用1公斤厘米2，121灭菌分钟。灭菌后倾斜摆斜面，然后放在30恒温箱中使培养基上蒸汽水逐渐干燥，再置冰箱中保存待用。要求：（）麦芽汁浓度应为1112巴林，p5以上，制成的麦芽汁应为淡黄色透明，无其它悬浮物质。（）斜面培养基需待表面蒸汽水干燥后，才能接种。（）制备培养基所用水份，应用自来水较好。二、摇瓶发酵条件试验摇瓶培养的目的有二：一是寻求发酵培养基的合适配方，二是寻找最佳发酵条件。微生物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程
5、，应用一般的简单比较法很难得到满意的结果，实验室中往往采用正交设计方法，对所研究的菌种进行试验。正交试验法是一种安排和分析试验的方法，这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的分析方法，获得较好的结果，它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目，利用正交表来进行整体设计。可以同时做一批试验，减少试验次数，缩短试验周期。通过分析，它能告诉我们，哪些因索是显著因素，哪些是非显著因素，以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大小，还能分析出试验误差的大小。正交试验包括两部分内容，设计试验方案和分析试验结果。（一）菌种与材料：茵种：同（一）摇瓶发酵培养基：葡萄糖、硫酸铵、KH2PO4 0.3、ZnSO4 0.
6、1、FeSO4 0.05（pH 5.1,温度30）材料：按正交表配制培养基，确定发酵条件。（二）方法与步骤：明确试验目的，确定试验因素，影响发酵的因素很多，考虑到实验室条件及人力和时间，我们不能在一次试验中包括所有因素，本实验主要从葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个因素，每因素选择三个水平，采用正交表9（34）。列出水平表，根据生产上发酵的现有了解，把葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个因素各分成三个水平。.选择正交表：根据人力、物力、试验任务，确定因素水平后，选出正交表。表头中L表示正交表，L右下脚9表示有9行，可用来安排9个试验。括号内底数3是因素水平数，指数4是4个因素。.根据因素水平
7、表（表头设计），把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字。试验结果分析从正交试验结果中，我们可以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是最佳理论值。我们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范围内，进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差，极差大小反应了因素变化时试验指标变化的幅度，因素的极差越大，该因素对指标的影响也会越大，也就越重要，就更需要控制在最佳水平上。验证正交试验结果。（三）操作：斜面菌种培养物环分别接入摇瓶发酵培养基，30，300转分钟摇瓶机上振荡培养2226小时，按正交表定时取出。培养期间要注意培养温度、环境清活和摇瓶机工作状态
8、。发酵完毕测定酵母及其核酸含量，填人表中进行计算和讨论。三、酵母生物量测量和核酸含量测定利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的计数法此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液注人血球计数板的计数室中，然后在显微镜下进行计数。实验器材及具体步骤，参看微生物学实验实验三十的有关内容。（二）用于核酸生产的酵母培养升发酵罐试验、实验主要内容和要求（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验应包括下列内容：用第一阶段在微生物实验中优选出的菌种，进行液体摇瓶种子扩大培养，供发酵接种用，种量自定。为保证发酵有较好的种子，可培养倍种量的种子，择优接种。进行发酵。包括配制发酵培养基，补料准备，空消和实
9、消，发酵过程的分析控制和适时分批补料。并要求发酵过程每一小时至少分析一次，分析项目为，醇母数、总糖、还原糖、核酸含量和菌体镜检，并记录结果。发酵过程中应根据发酵状况及时调节控制合适的风量、罐压、罐温和搅拧转速，适时补料，并且每半小时至少记录一次这些参数值。判定发酵终点，在发酵结束后冰箱保存，以备实验用。测定灭菌前后及工作过程的空气含菌量。测定并记录发酵液的溶氧浓度变化。（二）第二阶段实验内容多，综合性强，并且需要同学们独立制定实验的全盘方案和组织实验，故本次实验有以下几个要求:充分做好实验前的预习在实验前，要求同学们对实验的内容，所涉及的有关理论知识和曾做过的有关实验操作都要充分预习和复习，做
10、到心中有数。独立制定实验全盘方案在充分预习的基础上，以实验小组为单位，独立制定实验的全盘实施方案。并在实验前提交指导教师审阅后，按方案进行实验。方案内容大致包括：（）种子培养基配方、配制量和每个摇瓶的装量，灭菌温度和时间，培养温度和时同。（）发酵培养基配方和配制量，发酵罐空消、实消温度和时间，发酵过程中温度、通气比和搅拌转速。（）补料配方和配制量，灭菌温度和时间，计划补料时间，每次补料量。（）发酵终点判定方法。（）实验所需的各种器具、试剂。认真完成实验准备工作本实验分菌种培养、发酵二个阶段，并且发酵过程中又有补料、分析和控制，因此操作步骤和次数均较多。要求每次操作前都要做好准备工作，特别是无菌
11、器具要提前灭菌以备使用。认真做好发酵过程的观察分析控制和交接班工作发酵过程时间较长，操作内容多，故在发酵过程中应认真观察发酵过程中的各种参数，及时取样分析，根据发酵状况给予调节控制并适时补料努力把发酵控制在最佳状态。由于发酵时间长，在发酵过程中同学们将分组轮换值班故在交接班时，要做好交接工作。二、各种发酵因素对酵母的影响下面将各种发酵的影响因素提供给大家在制定方案和发酵控制时参考。发酵温度。各种微生物都有自己最适宜的生长温度，酵母最适宜的生长温度是30。如果发酵温度太高，在发酵时易产生沉淀现象。如果发酵温度太低，酵母发酵生长缓慢，产量下降。发酵。发酵液中的对酵母发育有很大的影响，因为影响到酵母
12、的生理机能，在酸性培养基中，水份及其中的营养成分，容易渗透到细胞原生质内。化学因子的影响。不同的微生物对某些化学因子的稳定性表现不同。各种酵母的含量因培养条件而定，若提高铵离子、磷酸离子的浓度，的含量就会增加。培养基的比率低时，的含量较高。在培养基中添加由2+、2+、2+组成的混合液，对的含量具有明显的促进效果。通气量。酵母属兼氧性微生物，在供氧和缺氧的条件下，酵母细胞的生命活动和能量转换是不同的。在有氧条件下，酵母进行有氧呼吸，糖被分解为水和2。在无氧条件下，酵母对糖进行发酵，糖被发酵乙醇和2。因此醇母培养需要有适当的含氧量。三、实验可供条件说明实验室有电热锅炉装置一套，主要供发酵罐的空消和
13、实消之用。空消应采用蒸汽直接进罐方式，可同时打开发酵罐上下二个蒸汽进罐阀门（见发酵罐示意图）二路进汽灭菌。同时应打开发酵罐与外部连接的所有管道阀门通汽，消灭死角，但应注意为节约用汽，这些管道阀门应尽量开得小些，以见有汽排出为度。另外对发酵罐无关的阀门都应关死，以免蒸汽旁泄浪费。在实消时，为避免罐内冷凝水过多，可采用夹套进汽方法间接灭菌，但间接灭菌也会造成培养液蒸发而减少体积，故可适当直接进汽补充冷凝水。总之既要保证灭菌效果，又要注意不使培养液体积有较大变化，实消应开动搅拌。实验室有空气净化系统一套，提供发酵无菌空气。无菌空气流量可见空气流量计，调节进排气阀门可使空气流量及罐压控制在预定值。发酵
14、罐自来水系统用于冷却和洗罐。发酵过程中应注意不能打开进罐水阀，否则会造成杂菌污染。发酵罐系统控制装置见发酵罐系统和控制柜示意图。板框过滤机供过滤发酵液使用。发酵分析用的仪器、器皿、试剂基本上与微生物实验相同。四、实验注意事项发酵罐操作时，柜子内的许多接头都是裸露带电的，故不能触摸，以免触电。发酵罐在空消和实消时，不能随意触摸罐体和管道，以免烫伤。因发酵时间长，需轮班操作，故每组人员多，应注意实验室的秩序。并且每位同学都应主动积极参与实验的全部过程。发酵罐的压力不能超过公斤厘米2，这是在蒸汽灭菌和通入无菌空气时都应特别注意的。所有阀门开关时，动作应缓慢些，特别是蒸汽和空气进人阀门。五、实验报告要
15、求实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。实验报告内容包括：（）目的意义。（）实验内容概述。（）实验的详细记录。（）对实验过程、记录和结果的分析讨论和总结。（）实验心得体会，对本实验意见评价。主要参考书武大、复旦合编：微生物学，高教出版杜（二版），范秀云等：微生物学实验，高教出版社中科院数学所数理统计组编：正交试验法。人民教育出版社，上海市食品工业公司编：酵母生产技术知识，日氨基酸。核酸集谈会编，嶷克旭等译：核酸发酵。轻工业出版社，林绿君袁惠民：啤酒酵母和微生物管理。轻工业出版社第二部分 的制备和核苷酸的离子交换层析分离实验原理核酸是生物体的重要组成物质，是生物
16、遗传的物质基础。它在生物体的生长、发育、繁殖、遗传变异等基本生命过程中起着重要的作用。核酸是由许多单核苷酸构成的多聚物。单核苷酸是由磷酸、核糖和碱基所组成。依据其核糖的结构不同，可将核酸分为核糖核酸（）和脱氧核糖核酸（）。从年代开始，大量研究表明，核酸及其降解物、衍生物具有良好的治疗作用，因而迅速发展成为一大类生物药物一核酸类药物。核糖核酸（）广泛存在动物、植物和微生物之中。本实验选用稀碱法，从酵母中制备：即用氢氧化钠溶液，使细胞壁变性，以改变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释放出来，再用酸中和，然后除去菌体，将凋至的等电点（12.5）。使沉淀下来，干燥，即得成品。核苷酸的分离纯化采用离子交换层析
17、法。离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引人若干大量功能基团。这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能。作为不溶性母体的高分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引人的功能基团可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸基（3）、中强酸型的含有磷酸基（）、弱酸型的含有羧基（）或酚羟基（）。也可以是碱性基团，如强碱型的含季铵+（3）3、弱碱型的含叔胺+（3）2、仲胺（3）、伯胺（2）等。在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两者数量之比叫分配系数（平衡常数）。理想的
18、情况是洗脱曲线和分配系数相配合，且分离的各种物质的分配系数，应有足够的差别。 当有、两种溶质进行离子交换柱层析时，吸附在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分配系数成反比，因此从原点到、两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值，各波峰的幅度和形状由柱长及其它因素（如交换树脂颗粒的大小、形状、交联度、流速等）所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及两者之间的空间关系等因素的影响。在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸
19、。为了增加核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：（）控制条件，使单核苷酸带上大量相应的电荷。这主要是通过调节值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨基、烯醇基）解离，四种核苷酸相对分配系数与值的关系如附图。（）减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子的强度，洗脱时则相反，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低；增加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对核苷酸的非极性吸引作用减弱。可被碱水解成或核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯二乙烯苯，磺酸型）或阴离子交换树脂（聚苯乙烯二乙烯苯，季铵碱型）分离核苷酸。本实验利用强碱型阴离子交换树脂（强碱型、强碱型、国产、owexl，mleite
20、 或erolit等）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值：O.D250O.D260，O.D280O.D260，O.D290O.D260对照标准比值（见附表），可以确其为何种核苷酸，同时也能算出中核苷醛的相对克分子比。实验步骤、的制备取一部分酵母泥（例如），置培养皿内，于烘箱内烤干，测定其含水量。酵母泥一般含干酵母。加水将约克酵母泥调成干重的菌悬液，再加入浓的（如）氢氧化钠溶液，使氢氧化钠的最终浓度（即提取时的浓度）为。在条件下电动搅拌分钟（如室温在以下，可延长时间至小时）。然后用、.和的盐酸（从粗调到细调）中和至，再搅拌分钟，直火或蒸汽迅速加热到，在该温度下保持分钟，迅速下降到以下
21、（先用水冲冷至室温，再放到冰箱）。离心（转分，分钟）沉出蛋白质和酵母残渣。取出上清液，用、和盐酸调至（的等电点）。低温放置过夜。离心（，分钟）收集沉淀，用少量乙醇洗二次，烘箱干燥。所得的制品，色微黄，产率为，含量可达。二、离子交换层析分离单核苷酸离子交换树脂预处理：用ml量杯量取约ml湿（*）树脂置于ml烧杯中，先用去离子水洗去色素及杂质，用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒；再用倍体积的 NaOH浸泡半少时，并不时搅拌，用去离子洗至中性，再用倍体积的浸泡半小时，不时搅拌，然后用去离子水洗至中性，抽滤法抽干，备用含水量测定：精确称取事先已处理好并抽千的氢氧根型阴离子交换树脂（即上述树脂）约克，下烤
22、干至恒重，计算其含水量。总交换容量的测定（）静态法精确称取上述抽千湿树脂约，放入三角瓶中，用吸管吸取ml标准溶液（约）加入树脂中，放置约小时，要求树脂全部浸入溶液中然后用吸管分别从中取出均等体积放入两只三角烧瓶中，以酚酞作指示剂，用标准溶液（约）滴定至粉红色出现，且半分钟不退色，即为滴定终点，取两次滴定的平均值。（）动态法；转型精确称取约抽干树脂（型），用小漏斗加到柱中，用去离子水（约）洗至中性；洗脱用溶液流过树脂，并收集流出液，直至流出液为中性为止单核苷酸的制备及离子交换层析法分离（）样品处理取毫克上述RNA制品，溶解于ml0.3氢氧化钾溶液中，于水解小时，在碱作用下水解成单核菁酸，水解完成
23、后，用过氯酸溶液调至以下，以转分，离心分钟，取上清液，用氢氧化钠溶液调至，纸电泳法检测四种核苷酸的存在，用紫外分光光度计测定其总OD260值。（）离子交换树脂的转型将树脂装入柱内，用甲酸钠溶液洗，直至流出液中不含氯离子（用硝酸银溶液检查）最后用100ml 1甲酸洗，直至260nm处光密度值低于0.03并用蒸馏水洗至接近中性，即可使用。（）离子交换柱的安装取内径cm的层析柱，将处理好的强碱型阴离子交换材脂悬浮液一次倒人玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在村脂面上，缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上（注意在整个操作过翟中防止液面低于村脂，当液面低于村脂表面时空气将进人，在村脂
24、柱内形成气泡，妨碍层析结果）经沉积后离子交换树脂柱床高约10cm（）加样将水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50ml蒸馏水淋洗树脂柱碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出（）核苷酸混合物的冼脱收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光上光度计上测260nm处光密度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.02）时，可用甲酸及甲醚钠溶液进行冼脱依次用下列冼脱液分段洗脱，500ml0.02M甲酸；500ml0.15甲酸；500ml0.01甲酸0.05甲酸钠溶液（）；最后用500ml0.1甲酸0.1甲酸钠溶液（）用部分收集器收集流出液，控制流速8ml/10分，8
25、ml管（）由层析柱所得各部分洗洗脱液的分析以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液为空白对照，用紫外分光光度计测各管溶液在260nm波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横座标，光密度值为纵座标作图，分析各部分波蜂位置分 析 方 法核酸样品纯度的测定（）准确称取待测的核酸样品0.5克，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用一氨水调至，定容至ml（）取两支离心管，甲管内加入2ml样品溶液和ml蒸馏水；乙管内加人ml样品溶液和ml沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置分钟，转分，离心分钟从甲、乙两管中分别吸取毫升上清液，用蒸馏水定容至ml。选用光程为厘米的石英比色
26、杯，在毫微米波长下测其光密度如果己知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（微克毫升）在紫外分光光度计上直接测定。核酸溶液含量的测定取支离心管，每管各加人ml待测的核酸溶液，再向甲管内加ml蒸馏水，向乙管内加ml沉淀剂。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置分钟，转分，离心分钟。将甲、乙两管的上清液分别稀释至光密度值在之间选用光程为厘米的石英比色杯，在纳米波长下测其光密度3.核苷酸纸电泳法（参见生物化学实验讲义）实验试剂与器材一、试剂及其配制10氢氧化钠溶液；6盐酸；95乙醇（AR）；1M 甲酸：取21.4ml88甲酸定容至500ml；1M 甲酸钠溶液: 称
27、32.15甲酸钠用水溶解定容至500ml；0.02M甲酸取10ml 1M甲酸定容至500ml；0.15M甲酸；取75ml 1M甲酸定容至500ml；0.01M甲酸一0.05M甲酸钠溶液（pH4.44）: 取5ml1M甲酸，25mlM甲酸钠溶液定容至500ml；0.1甲酸一0.1甲酸钠溶液（3.74）：取50ml甲酸、50ml1甲酸钠溶液定容至500ml；. 0.3氢氧化钾溶液: 取1.68氢氧化钾用水溶犀定容至100；N过氯酸:取17ml 7072过氯酸定容至100ml；0.1NH4Cl,0.1N NaOH标准溶液；硝酸银溶液；强碱型阴离子交换树脂（聚丙乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型，全交换量大
28、于毫克当量克干树脂，目）；15柠檬酸缓冲液（0.05，3.5）1000；酚酞指示剂；甲基橙指示剂；精密试纸（，）；核酸样品（）；氨水：用氨水稀释倍；核苷酸（、）标准品；沉淀剂：任选一种，操作和效果部相同。Mac Fadyen试剂刃醋酸双氧铀溶于三氯乙酸中。钼酸铵一过氯酸试剂：0.25钼酸铵溶于2.5过氯酸中如配毫升，即在毫升蒸馏水中加人毫升过氯酸和克钼酸铵。二、器材；烘箱；电动搅拌器；桶或缸；4离心机；滤布；新鲜啤酒酵母；7玻璃层析柱（内径1.1厘米，高20厘米）；8馏份自动收集器；紫外分光光度计；10恒温水浴；11层析滤纸；12电泳仪；13分析天平；14冰浴或冰箱；15烧杯（10、250、500ml）；16离心管（10ml）；17容量瓶（10、50、100、500ml）；18吸量管（0.5、和ml）；19药勺和玻璃棒；20试管和试管架；21微量注射器；22电热吹风机；23紫外灯；24酸、碱式滴定管；25秒表；26电子蠕动泵；27电炉；28称量瓶只，沙芯漏斗，抽滤瓶，滴管，量筒（杯）试剂瓶只。主要参考书颐觉奋主编分离纯化工艺原理，中国医药科技出版社（）孙彦主编，生物分离工程，化学工业出版社（）吴梧桐主编，生物制药工艺学，中国医药科技出版社（）张龙翔主辐，生化实验方法和技术，人民敦育出版杜（）毫升），容量瓶（、
