1、,特点2.细胞化学反应及可见性,酶细胞化学技术免疫细胞化学技术放射自显影原位杂交技术,酶+底物反应显色反应抗原+抗体反应 显色反应放射性同位素衰变和 射线的释放反应感光核酸杂交反应 显色反应,实验目的,掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如 何获得好的实验结果,人体和其他多细胞生物都由细胞按特定方式有序构建,皮肤组织,死去的 角质化细胞表皮细胞,基膜真皮细胞,细胞内锚定蛋白（与骨架附着）,跨膜黏附蛋白（黏附分子）,锚定连接的构成：,细胞内锚定蛋白（Vinculin）位于质膜胞质面，提供细胞骨架成分附着点。细胞骨架（actin）跨膜黏附蛋白,实验原理,原位
2、检测抗原抗体特异反应,间接法,间接荧光抗体染色法示意图,抗原,抗体,荧光素标记 的抗抗体,激发光,显示荧光,Vinculin的检测,，,实验原理,微丝骨架的检测,肌动蛋白：细胞骨架微丝的单体鬼笔环肽：是一种高亲和力F肌动蛋白探针，可与F肌动蛋白特异结合。四甲基罗丹明（TRITC）：激发光/发射光波长:540/565 nm红色荧光染料。skin fibroblast labeled with rhodamine phalloidin.荧光探针 罗丹明标记鬼笔环肽可特异性的标记F肌动蛋白，并发出具有独一无二的高亮度和光稳定性的红色荧光。,实验用品,试剂固定液：4%多聚甲醛,封闭试剂：10%正常山羊
3、血清0.2%Triton X-100一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体（abcam）,二抗:Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG（invitrogen）罗丹明标记的鬼笔环肽：（Rhodamine Phalloidin，invitrgen）DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）：（碧云天）PBS洗涤缓冲液：PH7.4,Hela细胞 细胞培养皿 荧光显微镜,材料及仪器,一，细胞制备和细胞固定,实验步骤,将细胞铺在 24孔板中,将细胞培养 至所需密度,固定,染色 或保存,PBS洗涤,实验步骤,二，细胞免疫荧光（ICC）染色,0.2%TritonX处理5min,封闭室温30min
4、,4过夜,371-2小时,375-10min,荧光,显微镜,观察,加入一抗,加入二抗 和鬼笔环肽,加入DAPI复染,PBS洗涤,PBS洗涤,PBS洗涤,实验结果,红色：微丝绿色：vinculin 蓝色：细胞核,注意事项,细胞密度:60-70%防止细胞污染固定时间:一般5-30min漂洗:必要时用恒温摇床摇洗激光共聚焦显微镜:专用培养皿,细 胞 污 染,免疫细胞化学技术,免疫荧光技术免疫酶技术标记物免疫亲和技术免疫胶体金技术,特异大分子在组织细胞原位的定位、定性,“Step by step”实验步骤,固定fixation,包埋embedding,切片sectioning,抗原修复antigen
5、retrieval,封闭blocking,一抗孵育1st Ab incubation,二抗孵育2nd Ab incubation,酶底物显色enzyme substrate,封片和观察Mounting/observation,实验样本,1，石蜡切片（Paraffin-emnedded sections）,石蜡包埋1.乙醇梯度脱水：50%、70%、80%每次1h,95%、100%各两次1h.二甲苯两次1h.恒温箱中浸蜡两次4小时。使用包埋机包埋。脱蜡/复水1.65烤片1h。2.二甲苯两次5min。3.乙醇梯度复水：100%、95%、70%、50%、30%每次5min。4.水/PBS漂洗5min。
6、,实验样本,2，冰冻切片（Frozen sections）,冰冻切片HE染色,石蜡切片HE染色,固定,正确的固定是免疫组织化学方法的关键，免疫组化无法检测一个已经不存在的抗原,组织块迅速浸入固定液，最大限度保护抗原。样本不要太大，保证完全浸润。固定液浓度：浓度越大，固定程度越好。固定时间与温度：时间越长，温度越高，固定程度越深。,交联试剂,如：中性甲醛溶液、多聚甲醛、福尔马林等，有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，降低抗原性，因此需要进行抗原修复。有机试剂如：预冷的甲醇、乙醇、丙酮等，它们会吸去脂类使细胞脱水，并使蛋白变性，这种固定方法不需要再对细胞进行通透。,灌注固定：将固定液通过内循环
7、系统灌注到组织中，特别是脑组织的取材！,抗原修复,福尔马林或多聚甲醛固定会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。,蛋白水解酶37孵育10-20min。对样本损害较小，冰冻切片适用。,切片置于加热至98 的 修复液中约25min。,热抗原修复（HIER）,高压蒸汽法,微波法,水浴加热法,酶抗原修复（PIER）,胰蛋白酶（Trypsin）,胃蛋白酶（Pepsin）,蛋白酶K（Proteinase K）,热抗原修复,封闭,正常动物血清：不能与一抗同源最好是二抗同源,牛血清白蛋白BSA,降低非特异性结合（如免疫球蛋白IgG登）所造成的背景染色,没有封闭，高背景,有封闭，低背景,封闭,通透（perm
8、eabilization）,当抗体检测位于细胞内的目标蛋白时（包括抗 原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进 行通透。将样品在含0.1-0.2%Triton X-100的PBS中孵 10min。使用预冷的甲醇或丙酮固定则不需要通透。,一抗孵育,建议浓度,每一个新的实验都要找出合适的抗体浓度，使得特异性染色最大化并减少背景,二抗孵育,酶偶联二抗-,辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（AP）,荧光偶联二抗,-Alexa Fluor,DyLight,FITC,PE,生物素-使用亲和素（avidin）偶联的HRP 进行信号放大,酶标还是荧光标？,石蜡切片,适合使用酶 标显色系统,甲醛固定会增 加自
9、发荧光,组织内某些 成分如collagen 会有自发荧光,冰冻切片,适合使用 荧光标签,细胞样本、冰冻切片不 需要甲醛类固定液长时 间处理，避免自发荧光,使用荧光标签的好处:,能同时检测多个靶标蛋白，可以分开观察，也可以merge到一起可以观察共定位（co-localization）,显色时镜下观察显色程度，确定显色时间！复染免疫组化：苏木素（蓝色），核固红（红色）免疫荧光：DAPI、Hoechst,底物显色,封片并观察,在切片上盖上玻片来保存和保护切片，并能提升影像的质量。免疫组化：中性树胶免疫荧光：50%、75%或95%甘油抗荧光淬灭封片液抗荧光淬灭封片液（含DAPI）,常见问题,没有信号
10、/染色样本里没有目标抗原或抗体的特异性不好使用阳性对照优化抗原修复条件增加抗体浓度信号放大（生物素-亲和素系统）无抗原，用原位杂交技术检测蛋白表达NeuN在成熟神经元中特异表达 GFAP在胶质细胞中特异表达,高背景染色高背景盖过特异染色,常见问题,降低抗体浓度优化封闭条件缩短抗原修复时间使用阴性对照,高背景,低背景,调整固定方法优化抗原修复条件抗体的特异性不高,不正确的信号抗原染色位置不正确,常见问题,Hela细胞Rabbit monoclonal toTRAF3,细胞/组织的形态被破坏,冰冻切片形成冰晶破坏组织结构：固定后梯度蔗糖脱水。取材时组织块尽量小，固定充分。提高切片质量：切片时使用锋利的刀片、新鲜的防脱片载玻片等。,人肝癌组织CD31免疫荧光染色,结 构 破 坏,结 构 正 常,常见问题,思考题,检测人肝癌组织中蛋白A及蛋白B两种蛋白的共定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？请写出简略步骤。,A,B,
