1、肉制品加工学山东农业大学第三章第3章 屠宰后肉的变化及其生化机制热鲜肉：不具备严格意义上的食用品质肌肉（muscle） 食肉（meat）1.活体内肌肉收缩与舒张的生物化学机制在活体内，当骨骼肌细胞接受神经冲动或刺激而兴奋时，首先出现肌膜动作电位，该动作电位通过横小管膜一直传播到肌纤维内部，深入到终池的附近。而横小管膜去极化所爆发的动作电位，使终池膜结构中某些带点集团的移位（如Na+内流），从而引起膜对Ca+的通透性突然升高，于是贮存在终池内的Ca+就顺着浓度差向肌浆扩散，导致肌浆内Ca+的浓度升高。Ca+即与细微丝上的肌钙蛋白C结合，并使之发生构型变化，进而使肌钙蛋白-I分子构型也发生某些改变
2、，于是解除了横桥与肌动蛋白之间在安静时存在的抑制作用。结果出现了横桥在肌动蛋白相结合以及横桥的摆动。当横桥与肌动蛋白结合，形成肌动球蛋白复合物（actomyosin）时，横桥内的ATP酶被激活，催化肌球蛋白分子中的ATP分解并释放出能量，牵动肌动蛋白微丝向A带内滑行，导致肌纤维收缩。4Cross-bridgeATPHydrolysisCross-bridgeMyosinActinCross-bridgeMyosinActinActin-Myosin BindingCross-bridgeMyosinActinMyosin132ActinCross-BridgeDetachment(ATP Bi
3、nding)PowerStroke 兴奋时肌浆中Ca+的浓度比安静的时提高100倍（即由安静时的10-7M以下上升到10-5M）以上。随后，肌浆网上的钙泵在Ca+和Mg+存在的情况下，分解ATP获得能量，逆浓度差将Ca+由肌浆网转运回终池中，肌浆内的Ca+浓度下降，原肌球蛋白和肌钙蛋白恢复原来构型，形成横桥与肌动蛋白的抑制因素。于是肌动蛋白解离，ATP酶重新被抑制，肌动蛋白微丝就从A带滑出来，最后导致肌纤维舒张。三联管是兴奋收缩藕联的结构基础，Ca+是藕联的因子。2.屠宰后肌肉中糖原的酵解家畜屠宰后 氧气供应中断 肌内糖原的有氧氧化过程终止，肌内糖原经酵解形成乳酸。 肌糖原 （磷酸化酶）1磷酸
4、葡萄糖 （磷酸葡萄糖变位酶）6磷酸葡萄糖 （磷酸果糖异构酶）1,6二磷酸果糖 （醛缩酶）3磷酸甘油醛磷酸二丙酮（磷酸丙酮异构酶） （磷酸甘油醛脱氢酶）1,3二磷脂甘油酸 （磷酸甘油酸激酶）2磷酸甘油酸、 （磷酸甘油变位酶）2烯醇式丙酮酸 （丙酮酸激酶）丙酮酸乳酸同时，ATP降解为ADP，释放出磷酸，加上磷酸肌酸降解形成的磷酸，肉的PH值降低，直至下降到抑制糖原酵解酶的活性为止。每个糖原分子经EMP途径酵解后产生2个分子的ATP，每个分子糖原在氧的存在下进行有氧氧化则产生36分子的ATP。所以由于糖原的酵解，肌肉内的ATP数量减少，肉的PH值降低。宰后牛肉的PH值，乳酸和糖原含量的变化宰后时间（
5、小时）PH值乳酸（mg %）1621319.236.00314.766.04465.595.75512.8125.95600.0245.56700.6肉的极限PH值活体肌肉的PH值（7.07.2）家畜死后ATP ADP+磷酸 ； CP(磷酸肌酸) 肌酸和磷酸； 酵解 乳酸等作用，使得肉的PH值降低，抑制降低到糖原酵解酶的活性钝化为止，之歌PH值称为肉的极限PH值。哺乳动物肉的极限PH值因家畜的种类而有所差异。一般在5.45.6之间。3.肉的死后僵直家畜屠宰以后，随着糖原酵解的进行，原来柔软松弛的肌肉逐渐失去弹性，关节不活动而变得僵硬，这种过程被称之为死后僵直（rigor mortise）。由于
6、肌肉中ATP数量的减少，终池蓦地通透性升高，其内部贮存的Ca+被大量释放到肌浆中，只是肌浆中的Ca+浓度升高，诱发了和活体内一样的收缩机制，导致了肌纤维的收缩。家禽的死后僵直大一上可以分为三个过程1.死后僵直的迟滞期或尸僵前期；2.死后僵直的急速期或是尸僵期；3.尸僵后期。死后僵直的迟滞期或尸僵前期从屠宰厚道开始出现僵直现象为止，即肌肉的弹性以缓慢的速度消失的阶段，称为死后僵直的迟滞期（或尸僵前期）。家畜死后的早期阶段，为了维持肌肉组织蛋白质的有序结构和肌肉的温度。消耗的ATP由糖原酵解过程和磷酸肌酸体系提供，亦可维持相对较高的ATP水平，因此没有尸僵发生。当肌肉内的磷酸肌酸体系消耗尽后，仅靠
7、糖原酵解系统供应ATP，不能满足肌肉的需要，肌球蛋白和肌动蛋白逐渐结合形成肌动球蛋白并累积，肌肉开始僵直。死后僵直的急速期肌内糖原蓄积耗尽是由于算的蓄积而使糖酵解酶系统钝化时，糖原酵解过程则不能继续供给ATP，此时肌肉内ATP数量急剧减少，肌动蛋白和肌球蛋白迅速大量结合，肌肉弹性迅速消失而导致肌肉的僵硬。尸僵后期最后形成延伸性非常小的一定状态叫做肉的尸僵后期。肌肉达到最大尸僵时，肉的硬度可增加1040倍，并保持一定时间。不同种类家畜的背最长肌死后酵解和僵直过程的情况家畜种类急速期开始的时间min/37最初PH值（死后1小时）急速期开始时PH值极限PH值马2386.955.975.51牛1636
8、.746.075.50猪50674.6.515.57羊606.956.545.60家畜死后僵直的种类根据家畜死后极限PH值的差异，僵直可分为下属三种类型酸性尸僵 碱性尸僵 中间性尸僵酸性尸僵（acid rigor） 酸性尸僵多见于宰前保持健康、安静的家畜，属于正常屠宰且加工处理较好的尸僵过程。其特点是达到尸僵开始的迟滞期较长，急速期较短，肉的极限PH值多在于5.45.6的范围内。碱性尸僵(alkaline rigor)碱性尸僵多见于处于疲劳状态下屠宰的家禽所产生的尸僵。其特点是迟滞期和急速期都非常短，而且速度快，即使是在室温下肌肉也会产生显著收缩。僵直结束时肉的极限PH值大部分保持子中性范围。
9、中间性尸僵（intermediate type rigor）该种类型的尸僵多发于宰前处于饥饿状态的所发生的尸僵。其特点是迟滞期短，但急速期长，肌肉产生一定的收缩，肉的极限PH值在6.37.0的范围内。死后僵直与肉的保水性PH值5.45.6肌肉中主要蛋白质的等电点。肌球蛋白与肌动蛋白微丝之间的间隙缩小，肌肉内水分存留的空间减少。肌浆中的蛋白质在高温和低PH值作用下的变性沉淀。,4.肉的成熟和嫩化在没有微生物腐败发生的前提下，将肉在冻结点（freezing point,-1.5)以下防止一定的时间，使其增加风味和改善嫩度的过程称为肉的成熟（conditioning or ageing)。一般的，牛
10、肉需成熟24周，猪肉成熟610天，肌肉需成熟0.51天。成熟处理后肉的嫩度可改善50%60%。肉的成熟及其机理嫩度是决定肉品品质的重要指标，同时也是消费者最关心的肉的食用品质之一。牛肉的剪切力值与嫩度的关系（USA）剪切力值 kg/1.27cm-D嫩度5.5非常韧为了改善肉的嫩度，需要对屠宰后的肉在04条件下成熟一定的时间。一般的，牛肉需成熟24周， 羊肉需成熟710天， 猪肉需成熟5天， 鸡肉需成熟0.51天。成熟处理后肉的嫩度可以改善50%60%。1960年，Locker首次报道牛肉屠宰后，胴体的快速冷却将导致肌肉的过渡收缩和肉质的硬化（Degree of muscle contracti
11、on as a factor in the tenderness of beef.Food Res.25,304307）.这个基础性的发现被称为肉类科学的第一次革命，并引领了有关肌纤维直径和肌肉的超微结构变化与肉质关系的大量研究。肌节缩短、肌纤维直径增加导致了肉的韧化，是肉类科学中的第一次划时代的进步。肉类科学的第二次革命是我们清楚的了解和解释肉类嫩化的原因。TenderToughTough肉的嫩度的改善主要是由于肉中细胞骨架蛋白的结构脆化（断裂）所致关于上述组分结构脆化的机理，学术界倾向于内源蛋白酶理论。内源蛋白酶理论（Mohammad Koohmaraie）钙离子理论。肉的成熟过程中的内源
12、蛋白酶及其作用Hoagland(1917)发现，在排除微生物对肉的分解作用下，随着肉的成熟，肉中的非蛋白氮含量上升，于是认为肉嫩度增加时内源蛋白酶所致。参与肉类嫩化的蛋白酶必须满足下述条件（Goll,1983）:1.这种酶必须是肌肉中内源存在的；2.此酶在离体条件下对肌原纤维的降解必须与肉成熟过程中蛋白降解的方式相同或相似；3.这种酶必须与组织中肌原纤维充分接触。Of all the potential candidates, calpains are the only proteases that meat all of the above requirements.溶酶体组织蛋白酶（Lys
13、osomal Cathepsins）；钙激活中性蛋白酶（Calpains）；蛋白酶体（Proteosome）。钙激活蛋白酶特别是在微摩尔钙激活蛋白酶才是肉嫩化的主体。钙激活中性蛋白酶（Calpains）早期的学者在研究贮存过程中，与肉嫩度变化有关的肉的结构变化时发现，经贮存后，肉中出现了大量的紧邻Z-disc的肌纤维碎片（Takahashi ,1967）。 这种变化据认为与死后肉的结构脆化有关，而且这种结构变化能被EDTA所抑制，因此推测有二价阳离子介入这种肉的结构性变化（Davey,1969）。这种推测被Nakamura(1972)证实，他发现当把鸡肉浸泡在510mM的氯化钙溶液中时，肌纤维
14、的抗张强度（tensile strength）降低，同时发现将鸡肉浸泡在钙溶液中导致了肌原纤维中Z-disc的降解（Busch,1972）。从而从肌肉中分离提纯了m-calpain（当时称为calcium activated factor CAF或钙活化因子），并证实含有较多CAF的肌肉经死后成熟变化后，肉的嫩度较好。Calpains最早由Guroff（1964）从老鼠脑细胞中发现并确认。Busch(1972)首先从骨骼肌肉组织中确认，并由Dayton(1976)首先分离纯化。Calpain是存在于哺乳动物组织中的遍在性蛋白酶（Murachi,1981）.1981年Calpains被正式命名为
15、EC3.4.22.17。Calpains为半胱氨酸肽链内切酶（cysteine endopeptidases），主要分布于Z盘附近，最适PH为7.5（7.28.2）。Calpains有两种活性形式：可被mol水平的Ca+激活，称为calpains(calpains-)；可被m mol水平的Ca+激活，称为mcalpains(calpains-)。Calpains由分子量分别为80kDa和28kDa的两个亚基构成。calpains和mcalpains中28kDa的亚基是相同的，而80kDa的亚基仅有50%的同源性。牛的骨骼肌中大约含有25g/g的calpains。达到最大活性的时，两者被激活的钙
16、离子浓度分别为350M和400800mM。钙离子结合在两个亚基的C末端，使得80kDa的亚基降解为76kDa的片段，28kDa的亚基降解为18kDa的片段，从而使calpains被激活。贮存使得较大的片段进一步的降解，但是并没有导致酶活性的降低。较大片段的继续降解将导致酶活性的丧失。Calpains的活性能被EDTA或是EGTA永久性的抑制。肌肉中存在的钙离子足以有效的激活calpains，但一旦calpains被激活，由于它的不稳定性，其分离提纯将是困难的。另外在肉中还存在一种calpains抑制蛋白质calpastatin，calpastatin通过与calpains的活性中心与钙离子结合
17、中心结合而抑制calpains的活性，骨骼肌的肌肉中存在着足够数量的能抑制calpains活性的calpastatin。三种calpains家族成员的一般性质蛋白类型多肽最适活性半钙离子需求量calpain80,28kDa3-50Mmcalpain80,28kDa400-800Mcalpastatin不同，46,70-76,87kDa需要钙离子与calpain结合，钙需求量依赖calpain两种calpain都为依钙的半胱氨酸蛋白酶，最适PH为7.28.2Calpastatin、calpain和mcalpain分布于细胞内活体内calpain与特异性抑制剂Calpastatin形成复合体以非活
18、性的形式存在，当肌浆内Ca2+浓度升高时，Ca2+与calpain结合，当Calpastatin分离后转位到细胞膜上，与膜上的活性因子结合，发生自动降解，calpains由酶原形式转变为活化形式，然后与底物结合，从而分解蛋白底物；当肌浆中Ca+浓度降低calpain与膜结构分离，然后Calpastatin结合上来又形成非活性形式。酶原活化假说认为，Calpains的活化需要一个自动降解过程以使酶的活性位点“自由”，从而分解底物。80、30kDa二聚体为酶原形式，而18/76kDa二聚体为酶的活化形式。胞质内calpains的活化因子（如蛋白和磷脂）可以降低酶原自动降解所需的钙离子浓度和底物中存
19、在的特殊序列如富含酸性氨基酸PEST序列可是底物区域钙离子浓度升高，从而引发酶原的自动降解。膜结合活化假说认为，calpain活化并不依赖于自动降解，而是需要蛋白酶与细胞膜结合，导致调节亚基从催化亚基上解离下来。膜上存在的calpains异二聚体可以通过大小亚基的依钙分离而活化，从而起到分解底物的作用。在肉的成熟过程中，-calpain降解肌肉的结构性蛋白质和细胞骨架蛋白质，导致肌肉的结构脆化，从而完成肉的嫩化过程。不同的肉，其最终嫩度的差异在于肌肉中所含的-calpain的活性不同。在肉的成熟过程中，-calpain要想完成肉的嫩化过程，必须经过下述过程。1.肌浆中游离钙离子浓度的提高；2.
20、Calpains被钙离子激活；3.激活的calpains分解蛋白质，脆化肌肉的结构，完成肉的嫩化过程。猪肉中总的钙离子浓度为1.5mmol/kg，牛肉中钙离子浓度变化范围在0.6mmol/kg8mmol/kg，平均为1.6mmol/kg(Lawrie,1991).在活体内，肌肉中游离的钙离子浓度约为0.2M（Kurebayashi,1993），远低于激活-calpain所需要的浓度。家畜被屠宰以后，随着糖酵解的进行，肌肉内的ATP数量降低，肌浆网内贮存的钙离子被大量的释放到肌浆中，使得肌浆中钙离子浓度上升到约100M（最大尸僵时），这个游离的钙离子浓度足以有效的激活-calpain，但不能激活
21、m-calpain。因此尽管-calpain和m-calpain为同工酶，但到多数学者认为-calpain在肉的嫩化中起到最重要作用。Dransfield(1992)证实，肌肉硬度变化的68%是由-calpain所引起的，且68%的-calpain存在于Z盘，14%在A带，20%在I带（Kumamoto,1992）.肌浆中游离钙离子的浓度，因家畜死后肌肉僵直的类型和性质而有所不同羊的背最长肌在15保存时，其钙离子浓度由宰后5小时的0.1M上升到最大僵直时的25M，而保存在4时则为30M，0时为37M。游离钙离子浓度的增加主要发生在死后僵直期，进一步贮存过程中，右路钙离子浓度是否进一步升高尚不清
22、楚。有学者认为，最大尸僵后肌肉的渗透压变化较小，因此推测贮存过程中游离钙离子浓度的增高量不大。由于calpains需要一定浓度的游离钙离子才能发挥作用，因此肉的嫩化作用在尸僵过程中就开始了，随着尸僵的进行，游离钙离子浓度的进一步升高，嫩化作用加速，直到达到最大尸僵。到目前为止，上没有直接的证据显示calpains在活体内或刚刚屠宰的肌肉中具有活性。当-calpain被激活以后，随着贮存时间的延长，其活性逐渐降低，说明-calpain中活性中心的数目逐渐减少，也就意味着贮存过程中-calpain发生了一定程度的降解。Calpains一旦被激活，其稳定性降低，部分的calpains将发生降解，就是
23、说被激活的calpains的活性将随着时间的延长呈指数性降低。经24小时的贮存后，冷却牛肉中-calpain的活性将降低50%，而calpastatin的活性降低约39%（Dransfied,1999）.温度对calpains的活性有影响，模拟实验的结果发现，calpains分解蛋白质的最是温度范围在中温区，亦指在1020的范围内，calpains分解蛋白质的数量大于低温（0）和高温（40）.添加钙离子鞥激活肌浆内的calpains，从而提高嫩化效果。其原因可能是外源性钙离子激活了肌浆内在正常肌内钙离子浓度下不能被激活的m-calpain的缘故。有报道说达到最大嫩化子熬过所需要的外源钙离子浓度
24、为30M（30M CaCl2溶液浸泡，此时肉中钙离子钙离子浓度约为33mM。Alarcon，1995）。Cytoskeleton as the key substrate肉的成熟过程中-calpain的作用及其机理的系列研究显示，在肉的嫩化过程中肌原纤维蛋白质的降解发挥了重要的作用，这一结果首先由Takahashi于1967年发表。Davey (1969)发表的第一张肌肉的超微结构照片，清楚的显示了肌原纤维在靠近Z盘处的断裂。后继的继续研究进一步显示，肌原纤维的断裂点位于I带和Z带的结合处，这也说明了I带的Actin和Gap filaments在A带和Z盘之间是连续存在的。肌原纤维在I带和Z盘
25、结合处（）靠近Z盘的I带上的断裂，直接与肉的嫩化有关。而且这一断裂在牛肉、猪肉、肌肉和鹿肉中时相似的。同时，Devey认为肌原纤维在靠近Z盘处I带上的断裂需要肌浆网中钙离子的释放。细胞骨架蛋白质的降解是肉类嫩化的原因。这些细胞骨架蛋白参与了肌原纤维间(desmin and vinculin)/肌原纤维内（titin,nebulin,and possibly troponin-T）的连接和通过constameres连接肌原纤维与肌纤维膜或肌纤维与韧带（basal lamina）的连接（laminin,fibronectin and the newly described kDa protein。
26、这些蛋白质的功能时维持肌纤维和肌原纤维结构的完整性。在肉的成熟过程中，被降解的三个主要cytoskeletal protein是：titin、desmin和constameric protein/Titin 和Desmin是Calpain降解并影响肉的嫩度的关键底物，Costameric protein(Vinculin）降解的速率与肉的剪切力值直接相关，但可能并不是据顶肉的最终嫩度的限制因素。在电镜下肌原纤维超微结构中，粗肌丝和细肌丝的重合部分以外，我们还能看见一种被称之为间隙微丝（gap filaments）的结构。Williamson 证实，这种间隙微丝由来年个重大分子量的蛋白质titi
27、n和nebulin组成，它们分别占肌原纤维蛋白质的10%和5%。Titin可能是间隙微丝的主要蛋白质，因此间隙微丝更准确的应当称之为T-微丝。Connectin( titin) 是一种由弹性蛋白组成的连接粗肌丝与Z盘的细微丝。每个connectin微丝的长度为m，约等于一分子-connectin的长度。Connectin微丝在固定肌节中央游离的肌球蛋白微丝的拍了秩序上具有更重要的作用，其性质决定了骨骼肌肌肉组织的弹性。肌原纤维间连接蛋白质desmin，起着固定肌原纤维，保持整个肌细胞内肌原纤维拍了的有序性等作用。Costameres通过连接肌原纤维和肌膜，起到稳定肌细胞结构的功能，其主要是vi
28、nculin组成。在骨骼肌肌细胞中，位于肌浆附近的肌原纤维在每一I带水平上都有costameres结构。肉的成熟过程中的钙理论在肉的僵直过程中，肉的PH值降低到5,5左右，ATP消失，而且肌浆中钙离子浓度升高到0.2mM，这一浓度大约是正常肌浆钙离子浓度的2000倍。在4条件下，牛肉肌浆中钙离子浓度增加到0.2mM约需要4天，猪肉大约3天，鸡肉需20小时。日本学者Takahashi 认为，内源酶在肉的成熟嫩化过程中所起到的作用数可以忽略的。原因有三：4条件下，经过一个月成熟后的牛肉中的cathepsin B依然被保存在溶酶体中，并没有扩散到肌浆中（Lacourt ，1986）。肉的嫩化程度和速
29、度与肌肉内cathepsins B 和L的量并没有直接关系（包括任何种类的肉。Etherington，1987）；尽管cathepsins具有降解肌球蛋白、肌动蛋白和-actinin的能力，但是这些蛋白质在肉的成熟过程中并没有发生变化。而且，唯一对肉的成熟嫩化有恭喜的-calpain，在死后肉的生理条件下其活性是非常低的。同时认为，成熟过程中肉的嫩化主要是肌浆内游离钙离子浓度升高，导致的Z盘脆化和尸僵造成的强直收缩、以及细胞骨架蛋白结构变化的缘故，即钙理论（the calcium theory）。肌原纤维结构的脆化Z-disc的脆化Z盘是哺乳动物骨骼肌细胞中连接相邻肌节的特殊结构，而且具有传递
30、肌节内粗肌丝和细肌丝交联所产生的张力的能力。Takahashi通过大量的研究证实，随着家畜死后时间的延长，骨骼肌细胞中的肌原纤维断裂成由14个肌节组成的微小片段，这种肌原纤维的小片化与死后肉的成熟嫩化有关，而肌原纤维的小片化则是由于Z盘的嫩化有关，而肌原纤维的小片化则是由于Z盘的脆化所造成的。Z盘的机构主要是由Z-filaments和一种无定形的基质（amorphous matrix）组成的，Z-filaments的主要组分是-actinin。这种无定形的基质在被0.1mM钙离子溶解后Z盘结构脆化并易于碎裂（见图）。近期的研究发现，这种无定形基质的主要组分是脂类物质，牛半腱肌Z盘中这种脂质的含量为1.8g/100g肌原纤维蛋白质。其中的主要成分为磷脂、三酸甘油酯、胆固醇和游离脂肪酸，它们呢的比例分别为65.8%、23.2%和2.4%。在肉的成熟过程中，磷脂的释放引起了Z盘的脆化，而在这一过程中，-actinin的量没有发生变化。在肌肉的生理条件下磷脂可能通过静电作用与-actinin结合在一起，由于高浓度的钙离
