1、鄂尔多斯市中心医院检验科微生物室,检测前：标本采集和运输检测中：涂片、接种、培养和药敏选择检测后：结果报告和解释细菌多重耐药和泛耐药,一、标本采集和运送合格的标本是检验质量的生命线,临床留取标本注意事项,尿标本采集:尽量采集晨尿，留尿前用肥皂将会阴及尿道口仔细清洗并冲洗干净，留取中段尿于无菌杯1/2处盖好盖，2小时内送检。对于留置导尿管病人采集标本时，应先消毒导尿管外部，按无菌操作方法用注射器通过导尿管吸取尿液，操作时注意防止混入消毒液。不能采集尿袋中尿液，尽量在更换尿袋时留取标本。痰标本采集:留取清晨、空腹、清洁口腔后的深部痰。尽可能在使用抗生素之前采集标本。于无菌痰杯留取1ml。尽快送检，
2、不得超过2小时。,呼吸道标本采集,晨起第一次痰标本对于成人中抗酸菌、真菌和其他病原菌的检出是最佳的。做痰培养的标本必须是下呼吸道的分泌物，采标本时一定要指导病人深咳。在样本采取前，病人需要进行口腔清洗或者漱口，也需要将假牙摘下来。支气管肺泡灌洗液对诊断肺炎比支气管洗液更好。这两种标本采集之后需要马上进行处理。当无污染的痰标本不容易获取时，支气管肺泡灌洗液将是一个很好的选择。,血液标本采集,1.采集方法1）首先要做好患者抽血部位的皮肤消毒程序：三步法：a 75%酒精檫拭静脉穿刺部位待干；b 10%碘伏作用60秒，从穿刺部位向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上；c.75%酒精脱碘。要用酒精而切
3、勿用碘伏消毒血培养瓶的瓶口橡皮盖。2）不宜从静脉导管或静脉留置口取血，若是上述部位取血应在申请单上注明。3）不推荐静脉血直接入瓶，以免血量控制不好，或对患者不利。4）在培养瓶上标明采血时间及患者姓名。2.采集时间 尽量在使用抗生素之前进行，对间歇性寒战或发热应在寒战前或寒战后1h内体温高峰到来之前采集血液，怀疑布鲁杆菌感染在寒战后或发热时采集血液。感染性心内膜炎时24小时内采集23份不同部位血标本做培养。3.采集量及保存：一份血培养指：需氧和厌氧各一瓶，建议需氧和厌氧瓶在不同部位各采两套，以提高阳性检出率。一般采集要求需氧8-10ml。，厌氧8-10ml。儿童瓶取45ml，标本接种到血瓶后，轻
4、轻颠倒摇匀以防血液凝固立送检，如不能立即送检的需室温保存，切勿冷藏。,血培养采集,由于在开始抗菌治疗后患者血液中的致病菌不会立即清除，25 天内无需重复进行血培养。但对于感染性心内膜炎患者，应多次进行血培养以评估和指导治疗；由金黄色葡萄球菌引起的败血症（非感染性心内膜炎），应在4896 h 重复培养以判断其是否为复杂性金黄色葡萄球菌败血症。对于新生儿，采集一瓶儿童瓶（需氧瓶）。,采血指征,发热（38C）或低温（36C）寒战 白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核的白细胞）粒细胞减少（成熟的多核白细胞1000109/L）血小板减少 皮肤粘膜出血 昏迷，休克多
5、器官衰竭 CRP升高PCT，G试验升高,血培养采集时间,血培养采集数量,Cockrill2004年报告:163位非感染性心内膜炎病人,血培养,分泌物和脓液的标本采集,对开放性病灶的采集：如手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应使用运输培养基。,明明送检的是一包脓液，可培养的
6、结果却是“无细菌生长”？,在标本采集前已经使用了抗生素 只做了需氧非苛养菌培养。而对于厌氧菌、L型细菌以及一些对氧有特殊要求的细菌都不能培养出来。标本采集后不及时送检或细菌室接种不及时，造成细菌的死亡。脓液组成物是坏死的白细胞和溶解的细菌、组织碎片，自然没有活细菌生长。建议除抽吸脓液送检外，再送检坏死和新鲜交界处的组织，取基底部或边缘部采样送检.这里有血供，细菌营养好，有活力，培养阳性率高。,采集伤口或脓液标本应注意的问题,针吸或组织培养比棉签拭子更可靠污染率低菌量足,易培养(涂片阳性率高)病原体生存时间长某些细菌生长不被抑制 尽量用新鲜组织作涂片组织暴露于固定液,可影响细菌观察,如G+和G-
7、特点不明显,难区分,植物分泌出来的：脂肪酸；树脂；福尔马林,腹部感染中提高厌养菌的培养阳性率,于床边接种厌氧血琼脂平板(必须经预还原)和普通血琼脂平板各一个，立即送实验室分别作厌氧和需氧培养。同时用无菌注射器抽取患者血液，排尽空气，注入需氧和厌氧血培养瓶，立即送检，分别进行需氧和厌氧培养。尽快作涂片检查,标本运送：1.标本采集后立即送检（2小时内送至实验室）。2.一般性的细菌培养标本延迟送检时，应置于4c保存且不超过24小时。血、脑脊液、生殖道等标本应在室温下放置，不要冷藏。疑是标本中有对周围环境敏感的微生物应立即运送至实验室。厌氧培养原则上应在床旁接种。实验室对于不合格的标本要拒收，建议重新
8、采集。,涂片、培养和药敏,二、标本涂片和病原菌培养,痰标本,痰涂片革兰染色，报告？,低倍镜观察痰涂片,革兰染色显微镜检,SEC10/LP，非下呼吸道标本或标本被口腔污染，不做药敏SEC25/LP，好的下呼吸道标本大量PMN，提示感染PMN吞噬细菌，提示感染涂片中发现特殊形态或特殊排列的病原体，需提示临床,真菌标本直接涂片的诊断价值,抗酸染色,弱抗酸染色-奴卡菌,病原菌培养,细菌培养针对不同标本选择不同培养基进行接种如痰标本要分别在血琼脂平板、中国兰或麦康康、巧克力培养基上接种。血培养瓶阳性报警后应接种在血琼脂平板、巧克力培养基上。尿培养应将标本接种在血琼脂平板上。粪便培养应将标本接种在血琼脂平
9、板、中国兰和ss培养基上。脑脊液、胸、腹水等无菌体液标本应将标本接种在增菌液、血琼脂平板、巧克力培养基上。脓液及创伤分泌物应将标本接种在血琼脂平板（巧克力）、中国兰或麦康凯平板上。,病原菌培养,温度：28，35，37，44气体环境：需氧，厌氧，微需氧，5%CO2培养基：血，巧克力，中国兰，麦康凯，SS，MH,液体培养基孵育时间：1 天，7天，42天.,药敏选择解读,药敏试验,概念:测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验。目的：检测可能引起感染的细菌对一种或多种抗菌药的敏感性。方法：纸片法、稀释法、Etest法,药敏试验,Etest,MIC,MI
10、C,MIC,K-B法,正确的药敏结果对临床意义重大,正确的药敏结果是临床医师选用抗菌药物的重要参考，可提高临床治疗效果 正确的药敏结果可帮助监测本医院、本地区以至全国细菌耐药性变迁情况，以便采取及时有效的措施，防止或减少细菌耐药性的发生,报告方式 目前药敏试验结果的报告形式可分为两种:解释性分类报告,(即S:敏感;I:中介;R:耐药)和定量即最低抑菌浓度(MIC值)报告。,抗菌药物敏感性折点的判定及临床意义,我国普遍采用CLSI制定的药敏试验判断标准,中国CHINET细菌耐药监测及卫生部全国细菌耐药监测网(Mohnarin)是全国范围内主要的细菌耐药监测项目以上细菌耐药监测项目采用的药敏判定标
11、准均为CLSI制定的标准,CLSI(临床实验室标准研究所)简介,我院微生物室药敏选择原则,遵循卫生部将CLSI制定的药敏标准定为我国的部颁标准参照全国耐药监测网对指定抗生素的检测结合我院现有抗生素种类及使用综合考虑，进行药敏试验的优化选择,药敏试验组的选择,A组药物用于常规和首选试验其结果也应常规报告。B组亦可用于一级试验（首选药），但只是选择性地报告临床。例如当细菌对A组同类药物耐药时、对A组药物过敏、或无效的病例可选择性报告B组中的一些结果。C组包括替代性或补充性抗菌药物，可选择性报告。U组包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物；O组包含对细菌组有临床适应症，但在美国一般不作为常规测试与报
12、告的药物。,CLSI抗生素选择,常见细菌的药敏选择,肠杆菌科（大肠埃希菌）不动杆菌（鲍曼不动杆菌）假单胞菌属（铜绿假单胞菌）葡萄球菌属（金黄色葡萄球菌）嗜麦芽窄食单胞菌真菌,肠杆菌科细菌的抗菌药,肠杆菌科（大肠埃希菌）,不动杆菌（鲍曼不动杆菌）,假单胞菌属（铜绿假单胞菌）,葡萄球菌属（金黄色葡萄球菌）,嗜麦芽窄食单胞菌,真菌,细菌多重耐药性及泛耐药性,感染性疾病治疗中面临的问题,全球有关细菌耐药调查结果显示，耐药细菌的比例不断增加，多重耐药和泛耐药菌已成为临床常见感染病原体。我国细菌耐药调查在医院感染中常见的五种细菌是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌，这些菌不耐药
13、的细菌很少，而且耐药谱十分广泛。对耐药菌认识不足感染治疗困难新型抗菌药物研发陷入低谷,多重耐药菌和泛耐药菌,多重耐药菌（MDR)：一种细菌对临床使用三类（比如氨基糖苷类、大环内脂类、-内酰胺类）或三类以上抗生素同时耐药，而不是同一类三种抗生素耐药的细菌。泛耐药(PDR)：一种细菌对临床使用五类或五类以上抗菌药物均耐药称为PDR。如：抗假单胞菌头孢菌素类、-内酰胺酶抑制剂复合制剂、碳青霉烯类、氟奎诺酮类、和氨基糖苷类。泛耐药（PDR):除对多粘菌素外所有类抗生素都耐药的细菌称为泛耐药菌。非发酵菌多见。对所有抗菌药物包括多粘菌素都耐药的细菌称极耐药（XDR).,常见多重耐药菌,MASA(耐甲氧西林
14、金黄色葡萄球菌）MRCNS(耐甲氧西林凝固酶葡萄球菌）耐万古霉素肠球菌（VRE)庆大霉素高耐的肠球菌（HLHR)耐青霉素肺炎链球菌（PISP)产超广谱-内酰胺酶（ESBLs)细菌如：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌。耐碳青酶烯类抗菌药物肠杆菌科细菌（CRE)(如产I型新德里金属-内酰胺酶NDM-1或产碳青霉烯酶KPC的肠杆菌科细菌）耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌多重耐药或泛耐药铜绿假单胞菌和多重耐药结核分枝杆菌,卫生部要求监测的耐药菌,MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）VRE(耐万古霉素肠球菌)ESBLs（产超广谱-内酰胺酶细菌）耐碳青霉烯类抗菌药物的肠杆菌科细菌、鲍曼不动
15、杆菌、铜绿假单胞菌要有重点科室的排名前五位细菌及耐药情况每季度发布一次全院细菌分布情况及抗生素耐药情况多重耐药菌当日发现当日上报院感科和相关临床科室,细菌菌的耐药基理,、细菌产生内酰胺酶可水解内酰胺类抗生素，这是最重要和最常见的耐药机制。细菌产生氨基糖苷类钝化酶对氨基糖苷类如庆大霉素耐药；喹诺酮类耐约是由于旋转酶改变或药物渗透性改变；红霉素酯化酶：可水解红霉素结构中的内酯环而使之失去抗菌活性；氯霉素乙酰转移酶：使氯酶素转化为无抗活性的代谢物。,、抗生素的渗透障碍:由于细胞壁的障碍或细胞膜通透性改变抗生素无法进入菌体内发挥抗菌作用，当细菌外膜微孔蛋白缺失后抗生素也不能进入菌体。、外膜存在着药物泵
16、出系统（由et膜蛋白介导）使进入菌体内的药物主动泵出导致菌体内药物浓度降低，如对四环素类和喹诺酮类耐药等。,、靶位的改变:内酰胺类抗生素通过与青霉素结合蛋白（s)结合而抑制细菌生长，当靶位改变后抗菌药物不能与其结合而失去作用对磺胺耐药是由于细菌改变体内二氢叶酸合成酶，与磺胺药的亲和力降低引起的。,、非水解屏障机制：主要是染色体介导的型内酰胺酶细菌如绿脓杆菌、肠杆菌等对头孢类抗生素耐药并非抗生素的内酰胺环水解，而是由于非水解屏障的形成，由于内酰胺类药物与质周空间诱导产生的内酰胺酶结合成无生物活性的复合物而不能进入靶位发挥抗菌作用。细菌同时具有以上两种或两种以上耐药机制就产生了对多种抗生素的耐药性
17、。,对MRS感染的用药建议,1、根据CLSI指南提示，凡MRS菌株应报告全部-内酰胺类药物为耐药，而不考虑其体外的敏感性。（包括青霉素类、头孢类。含霉抑制剂的复方制剂、氨曲南、泰能）。由于MRS常常同时耐大环内酯、氨基糖甙和喹诺酮类药物，因此在严重感染经验用药时应首选万古霉素。在获得细菌室药敏报告后方可纠正。,2、MRS菌根据药敏情况也可选用替考拉宁（bi霉素）、氨基糖甙类、喹喏酮类、大环内酯类等药物，但必须有实验室的药敏报告。3、根据我院所做药敏表型实验，对于MRS菌感染者敏感性较强的药物有：万古霉素、替加环素、利耐唑烷、呋喃妥因、克林霉素、复方新诺明、莫西沙星进行治疗，严重者可选万古毒素和
18、替考拉宁。4、大手术后为防止深部金黄色葡萄球菌感染，使用第一代和第二代头孢菌素为好，第三代头孢菌素的长期使用，与MRSA的出现率呈平行关系。,、是质粒介导的，在一定条件下细菌将耐药质粒转移给同种属或不同种属细菌而传播快。、药物选择性压力导致产菌株不断增加。、医护人员通过手或使用器械传播、患者之间传播、正常人携带也是造成传播和感染的重要因素，在芝加哥的老人疗养院中，从半数老人的胃肠道内分离出产的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。6.产ESBLs的菌有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌,产菌株流行的原因,治疗选药和控制措施,菌株治疗选药原则、碳青酶烯类如亚胺培南（泰能）、美洛培南。、含内酰胺
19、酶抑制剂复合抗生素，如舒普深等、氨基糖苷类抗生素，阿米卡星。、头霉烯类抗生素，头孢西丁。,mp内酰胺酶及其检测,、mp内酰胺酶是头胞菌素酶，AmpC酶表现为对第一、第二、第三代头孢菌素和单酰胺类、头霉烯类、氨基糖甙类及抗假单胞菌青霉素均耐药。但对碳青霉烯类、第四代头孢菌素和氟奎诺酮类敏感。AmpC酶对酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦耐药，但对邻氯西林和氟氯西林敏感。、产生mp酶的菌株：肠杆菌属(阴沟肠杆菌，产气肠杆菌），弗劳地枸椽酸杆菌，粘质沙雷菌，铜绿假单胞菌，普通奇异变形杆菌，大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，摩根菌。,对产mpC酶菌株的治疗选药,、第四代头孢菌素如头孢吡肟（马斯平）对mpC酶是
20、低诱导，对内酰胺酶是低亲合力，对产mpC酶菌株有较强的抗菌作用，其敏感性与泰能相似，可作为替代性首选药。、碳青霉烯类如泰能，虽然其能诱导产生mpC酶，但只是暂时性增加，如果更换另一种抗生素，这种诱导会消失。碳青霉烯类耐酶性强，耐药率低，仍可选择敏感药治疗；、选择非内酰胺酶类如氟喹诺酮类和氨基甙类敏感药物、避免使用三代头孢菌素及其酶抑制剂,碳青霉烯酶,KPC酶,国内：已在肠杆菌科的多个菌属中有报道。肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌属、弗劳地柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌等。该类酶除阴沟肠杆菌可有染色体介导外，其他各类细菌均可为质粒介导，已成为临床治疗难题。,碳青霉烯酶治疗,由
21、于产碳青霉烯酶细菌的耐药机制比较复杂，目前尚无高效控制产该类酶细菌感染的药物，临床治疗方案还需依据药敏结果进行制定方案。多粘菌素、替加环素有较好的体外活性。单酰胺类药、环丙沙星、庆大霉素、酶抑制剂对于部分产该酶菌有活性。对于产OXA型碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌可选用舒普深。临床微生物室应扩大抗菌药物敏感性测定范围，如氨基糖苷类、喹诺酮类、多粘菌素和替加环素、米诺环素、磷霉素等。个别研究发现碳青霉烯类也有有效者需和其它药物联合使用。,产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌,泛耐药肠杆菌科细菌。耐药特点：2010年8月以来国际上陆续报道在印度、巴基斯坦、英国等地发现产NDM-1该菌产金属-内酰胺酶，对所有-
22、内酰胺类抗菌药、碳青霉烯类药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素敏感。产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌，主要为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、其它细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆菌、枸橼酸杆菌、产酸可雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登斯菌等。表型筛查：1.K-B法：美罗培南（10ug纸片）或亚胺培南纸片（10ug纸片）抑菌圈直径2mg/L;或亚胺培南MIC2mg/L。表型确认：双纸片协同试验:采用亚胺培南纸片（10ug纸片）、EDTA(1500ug)两种纸片进行K-B法，两种纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片一侧，EDTA抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。,NDM-1细菌治疗,产NDM-1细菌对碳青霉烯类及几乎所有-内酰胺抗菌药物耐药，同时由于细菌具有多种耐药机制，对氨基糖苷类，喹诺酮类等也多耐药，对多粘菌素和替加环素具有较高体外敏感性。临床微生物室应扩大抗菌药物敏感性测定范围，如氨基糖苷类、喹诺酮类、多粘菌素和替加环素、米诺环素、磷霉素等。个别研究发现碳青霉烯类也有有效者需和其它药物联合使用。,2009-2012年常见细菌多重耐药趋势,2010年我院细菌培养标本分布情况,2011年我院细菌培养标本分布情况,2010年我院临床科室微生物标本送检情况,2011年我院临床科室微生物标本送检情况,重点科室排名前5位细菌分布,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是各重点科室分离的常见病原菌,结束,谢谢大家,
