1、紫外可见分光光度法,刘晓燕,主要内容：,&重点难点：,q,紫外可见分光光度分析的基本原理,紫外可见分光光度分析的条件选择,紫外可见分光光度计的基本构造和使用流程,q,q,q,q,重点 朗伯比耳定律、分光光度分析的条件选择。,难点 朗伯比耳定律。,第一章分光光度分析(Vis-UV Spectrophotometry),第二章 紫外可见分光光度法,1.概念：分光光度法是根据物质的吸收光谱和光的吸收定律，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。2.方法分类：根据测定时所选用的光源：可见分光光度法(400800nm)紫外分光光度法(200400 nm)红外分光光度法(800nm50m),优点：灵敏
2、度高,主要用于微量分析；准确度高,浓度测量相对误差仅有13%；操作简便、迅速，所需设备并不复杂；应用广泛。缺点：仅适合微量分析；所需仪器相对昂贵。,3.紫外分光光度法的优缺点,5,第一节 紫外可见分光光度计的构造,分光光度计工作原理：采用一个可以产生多个波长的装置，通过系列分光装置，得到一束平行的波长范围很窄的单色光，透过一定厚度的试样溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光电元件上，产生光电流，在仪器上可读取相应的吸光度或透光率，完成测定。,一紫外可见分光光度计的基本组成,1光源,在所需光谱区域内发射连续的、足够强度、稳定的辐射光。可见区：钨灯；紫外区：氢灯、氘灯 通常用612 V钨丝灯作可见
3、光区的光源，最适宜的使用范围在360800nm。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。,色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同分光,2单色器单色器是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。其中色散元件是关键部件。,棱镜是根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。它由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：
4、利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,光栅是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。,入射狭缝：光源的光由此进入单色器，用于限制杂散光进入单色器 准直镜：透镜或凹面反射镜，使入射光成为平行光束 色散元件：棱镜或光栅，将复合光分解成单色光准直镜：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝 出射狭缝：用于限制通带宽度,3吸收池,吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测溶液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm
5、和5 cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。使用时注意点,4检测器,检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为6251 000nm；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200625nm。,光电倍增管是由光电管改进而成的，管中有若干个称为倍增极的附加电极。因此，可使
6、光激发的电流得以放大，一个光子约产生106107个电子。它的灵敏度比光电管高200多倍。适用波长范围为160700 nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。5显示装置 显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透光率T的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。,二、紫外可见分光光度计类型,1.单光束分光光度计,2.双光束分光光度计,3.双波长分光光度计,721分光光度计,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,单波长单光束分光光度计,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性，且
7、操作麻烦，任一波长的光均要用参比调T=100后，再测样品,仪器,可见分光光度计,双光束分光光度计,裂,仪器,紫外-可见分光光度计,双波长分光光度计,光源,单色器,单色器,切光源,检测器,吸收池,不需要参比溶液；可以消除背景吸收干扰；适合多组分混合物、浑浊试样的定量分析，可进行导数光谱分析。价格昂贵,三、仪器使用基本流程,紫外可见分光光度计,1、分光光度计的保养与维护2、操作的注意事项3、定性分析依据？定量依据？,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择性吸收,在一定实验条件下,Ac,第二节 紫外可见分光光度法的定性分析,1分子吸收光谱的产生 当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、
8、原子或离子等粒子与吸光子作用，光子的能量发生转移，使这些粒子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态。M(基态)+h M*(激发态),M(基态)+h M*(激发态)这个过程即是物质对光的吸收。由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续的，只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长不同。,2、光的种类具有单一波长的光叫单色光，比如红光，蓝光等。由不同波长的光组成的光叫复色光。比如日光等 如果两种适当颜色的单色光按适当的强度比例混合能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光
9、。,互补色光,溶液的颜色,溶液为什么会有颜色？溶液之所以呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。吸收光与溶液颜色的关系：当白光通过某一均匀溶液时：,CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的黄光，透过其黄光的互补光蓝光。,如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色；,如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色；,如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液呈透过光的颜色。,又例如：KMnO4溶液，吸收了白光中的绿光，透过的为其互补光紫色，故其溶液呈紫色。,再例如：NaCl、KNO3溶液，对其射入的可见光全不吸收，光全透过，因此溶液为无色。,2、吸收光谱曲线,某一溶液对何
10、种波长的光吸收？吸收的程度如何？这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的吸收程度吸光度 A，作A-曲线，即吸收光谱曲线。,溶液的光吸收曲线,最大吸收波长 maxKMnO4溶液的max=525nm,max,/nm,吸收强度,吸收强度,特点:具有最大吸收波长。不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。但是不同物质，其吸收曲线形状和max不一样，所以可作为定性分析的依据。不同浓度的同一种物质，在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定的灵敏度最高，所以通常选取在max处测量。,3、常用术语1）生色团：含有键的不饱和基团，简单的生色团由双键或三键组成（
11、如乙烯基、乙炔基等）2）助色团：本身没有生色功能（不能吸收波长大于200nm的光），但当与生色团连接时，有增强生色团生色能力的基团（如OH，NH2，NHR等）,3）蓝移（或紫移）：指吸收峰向短波长方向移动，红移：指吸收峰向长波长方向移动。吸收峰强度变化包括增色效应和减色效应。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。各种因素对吸收谱带的影响结果下图,4、常见有机化合物的紫外可见吸收光谱（1）270-750nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2）270-350 nm有吸收峰（=10-100L/（mol*cm），n*跃迁，含有一个简单的非共轭且含有n电子的生色团（3）250-300 nm 有中等强度
12、的吸收峰,（=200-2000L/（mol*cm），如苯环。（4）210-250 nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键；在260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，说明是3个或3个以上双键的共轭体系。（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环化合物,一、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和液层厚度间关系的定律,第三节 紫外可见分光光度法的定量分析,1、透光率和吸光度入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0 Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0 I
13、a+It,透射光的强度 It与入射光的强度I0的 比值称为透光率(T)透光率愈大，溶液对光的吸收愈少。透光率的负对数称为 吸光度(A)吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多。,1760 年，Lambert 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。A=k1 b1852年，Beer 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。A=k2 c将 Lambert 定律和 Beer 定律合并起来，就得到 Lambert-Beer定律。A=K b c,2、光的吸收定律(Lambert-Beer定律),A=K b c c：物质的量浓度(mol L-1)b：为液层
14、厚度(cm)K:吸光系数。应用的条件：入射光必须是单色光；吸收发生在稀的均匀的介质中；吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。,3、吸光系数 其数值的大小，与物质的性质、入射光波长、溶剂种类及溶液温度等因素有关。当波长等其他因素一定时，只与物质的性质有关。两种表示方法：a：质量吸光系数(Lg-1cm-1)；：摩尔吸光系数(Lmol-1cm-1)。特点：不随浓度和液层厚度的改变而改变，作为定性鉴别的参数；在max处的摩尔吸光系数，常用max表示，。不同物质的max有时可能相同，但max不一定相同，作为定性的依据；max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高,例：Cd2+浓度为1
15、40 umol L-1，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求 和T。解：(1)A=b c 0.22=2 140 10-6=785.7 L mol-1 cm-1(2)A=lgT=0.22lgT=0.22T=100.22=0.60=60%,例 一有色溶液的浓度为c mol/L，透光率为T。求浓度为原来的1/2时，透光率为多少？,解：T=10-bc c T,例 有色溶液的液层厚度增加一倍后，透光率和吸光度的改变为多少？,解：T=10-bc b T A,1/2c,T 1/2,T2 2A,2b,4、对朗伯比耳定律的偏离标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生
16、弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。1.非单色光引起的偏离,a,b,A2,A1,A3,A4,1,2,3,A,正偏离,负偏离,A,c,标准曲线,非单色光的影响,（1）物理性因素,单色光不纯，导致负偏差。,散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差,为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。,(2)化学性因素,吸光质点的相互作用，浓度较大时
17、，产生负偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C 10-2 mol/L)。平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrO42-2H=Cr2O72-H2O 溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。,朗伯比耳定律：A=abc。其中符号c代表b代表当c的单位为mol/L，b的单位为cm,则a以符号表示，并称为,有色物质的浓度,光通过有色溶液的厚度,摩尔吸收系数。,符合朗伯比尔定律的某有色溶液当浓度为C gmol-1时，透光度为T0、吸光度
18、为A0；若浓度减小一倍，则此溶液的透光度为，吸光度为。,T01/2,0.5A0,3.下列说法中正确的是（）A.当溶液浓度变大时其最大吸收波长变长；B.当波长固定时，被测溶液浓度变小时，其吸光度也变小；C.吸收池厚度增加一倍，其摩尔吸光系数缩小一倍；D.标准曲线的斜率越小，说明检测的灵敏度越高。,B,4.已知某波长的单色光经过液层厚度为1.00cm的吸收池后，吸光度为0.19，求该溶液的透光率。,5.若将某波长的单色光通过液层厚度为1.00cm的溶液，则透过光强度为入射光强度的1/4，问当该溶液液层厚度为2.00cm时，透光率（T）和吸光度（A）为多少？,（T=65%）,（A2=2A1=1.20
19、，T2=(T1)2=1/16）,根据 Lambert-Beer定律，以该物质吸收光谱图中的max为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cs，测其As，再将样品溶液推入光路，测其Ax，则试样溶液的浓度cx为：此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。,二、紫外可见分光光度法的定量方法,1.单一组分的测定（1）标准对照法,22:50:22,例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注
20、射液的浓度（单位ug/mL),1）对照法,测定步骤 首先配制一系列被测物的标准溶液，测其吸光度，绘出A-c工作曲线；在相同条件下，测出被测物的吸光度Ax;根据Ax的值在工作曲线上查处cx的大小。适用范围 大批重复试样的分析。,（2）标准曲线法(工作曲线法),未知物的吸光度,未知物的浓度,2、多组分的定量方法,三种情况：（1）两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自max下不重叠分别按单组分定量令E=b,（2）两组分吸收光谱部分重叠 1测A1b组分不干扰可按单组分定量测Ca 2测A2a组分干扰不能按单组分定量测Ca,22:50:22,步骤：,（3）两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定,物质的吸
21、收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。,63,第四节 紫外可见分光光度法的条件选择,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在1070,A在0.151.0之间(调c,b,),一、试样浓度的选择：,最佳值,最佳读数范围,二、入射光的波长的选择,“吸收最大max，干扰最小”,三、显色条件的选择,1.显色剂的选择 1.灵敏度高，选择性好。（一对一）CuNH3 e 620=1.2102 Cu双硫腙 e 533=5.0104 2.显色产物组成恒定,性质稳定。3.显色产物与显色剂色差大,显色 时颜色变
22、化明显.试剂空白值小。4.显色条件要易于控制，以保证其有较好的在线性。,2.显色剂的用量（由实验确定）,M+R=MR(被测组分)(显色剂)(有色化合物)R过量,反应完全,MR稳定,A值稳定.,选择曲线变化平坦处。显色剂用量过量、适量、定量。,3 显色温度、时间,适宜的显色时间和温度由实验确定（曲线平坦部分对应的时间和温度就是测定吸光度的最适宜时间）,四、酸度的选择,OH-,酸度的影响,副反应,M+nR=MRn,H+,存在型体的变化,RH=R-+H+,生成不同配比的络合物,例，磺基水杨酸(ssal)Fe 3+,pH=2 3,FeR,紫红色,pH=4 7,FeR2,橙色,pH=8 10,FeR3,
23、黄色,pH12 Fe(OH)3,沉淀,pH1pHpH2,选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区,五.干扰离子的影响及其消除方法,A、控制溶液酸度B、加入掩蔽剂C、利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态D、利用校正系数E、利用参比溶液F、选择适当的波长G、增加显色剂用量H、采用适当的分离方法，分离干扰离子,E.参比溶液(空白溶液),在测定时用空白溶液调节仪器A=0(T=100%),以消除溶液中其它物质的干扰,抵消比色皿对光反射、吸收.1)溶剂参比 试液、试剂、显色剂均无色(无吸收)则可用溶剂如纯水作参比溶液.,2)试剂参比 试液无色,显色剂或其它试剂有色(有吸收),则应选试剂空白.3)试液参比 试剂、
24、显色剂均无色(无吸收),试液中其它组分有色,则应采用不加显色剂的试液作参比溶液.选择参比溶液的总原则是:使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度.,22:50:22,例1取咖啡酸，在165干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL容量瓶中，加水至刻度线，取此溶 液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL 4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量。,解：,1、双光束分光光度计与单光束分光光度计相比，其突出优点是()(1)可以扩大波长的应用范围(2)可以采用快速响应的检测系统(3
25、)可以抵消吸收池所带来的误差(4)可以抵消因光源的变化而产生的误差,1、双光束分光光度计与单光束分光光度计相比，其突出优点是()(1)可以扩大波长的应用范围(2)可以采用快速响应的检测系统(3)可以抵消吸收池所带来的误差(4)可以抵消因光源的变化而产生的误差,2、双波长分光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在 1和 2处吸收之差(3)试样在 1和 2处吸收之和(4)试样在 1的吸收与参比在 2的吸收之差,3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4 溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）(1)蓝色光(2)绿色光(3)黄色光(4)红色光,2、双波长分
26、光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在 1和 2处吸收之差(3)试样在 1和 2处吸收之和(4)试样在 1的吸收与参比在 2的吸收之差,3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4 溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）(1)蓝色光(2)绿色光(3)黄色光(4)红色光,2、双波长分光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在 1和 2处吸收之差(3)试样在 1和 2处吸收之和(4)试样在 1的吸收与参比在 2的吸收之差,3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4 溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）(1)
27、蓝色光(2)绿色光(3)黄色光(4)红色光,5、KO4法氧化Mn2+到MnO4，然后用分光光度法测定，选择合适的空白为（）(1)蒸馏水(2)试剂空白(3)除K 外的试剂空白(4)不含KO4的溶液空白,6、现有紫外可见吸收光谱相互干扰的A和B两组分，它们的最大波长分别为A和B，若用双波长测定A组分的含量，则下面哪一种选择1和2的方法是正确的？()（1）使1和2分别等于A和B（2）选1等于A，选2使B组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等（3）选1等于A，选2为A，B两组分吸收峰相交处的波 长（4）选1等于B，选2使A组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等,5、KO4法氧化Mn2+到MnO4，
28、然后用分光光度法测定，选择合适的空白为（）(1)蒸馏水(2)试剂空白(3)除K 外的试剂空白(4)不含KO4的溶液空白,6、现有紫外可见吸收光谱相互干扰的A和B两组分，它们的最大波长分别为A和B，若用双波长测定A组分的含量，则下面哪一种选择1和2的方法是正确的？()（1）使1和2分别等于A和B（2）选1等于A，选2使B组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等（3）选1等于A，选2为A，B两组分吸收峰相交处的波 长（4）选1等于B，选2使A组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等,5、KO4法氧化Mn2+到MnO4，然后用分光光度法测定，选择合适的空白为（）(1)蒸馏水(2)试剂空白(3)除K 外的试剂空白(4)不含KO4的溶液空白,6、现有紫外可见吸收光谱相互干扰的A和B两组分，它们的最大波长分别为A和B，若用双波长测定A组分的含量，则下面哪一种选择1和2的方法是正确的？()（1）使1和2分别等于A和B（2）选1等于A，选2使B组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等（3）选1等于A，选2为A，B两组分吸收峰相交处的波 长（4）选1等于B，选2使A组分在2的吸光度和它在1处 的吸光度相等,
