1、毒理学第五章一般毒性作用及其评价含多选题及答案解析第五章 一般毒性作用及其评价一、学习的目的要求（一）学习目标1. 掌握一般毒性概念、分类及研究意义；2. 掌握急性毒性的概念、急性毒性试验的目的、常用参数、设计原则和方法；熟悉急性毒性常用的替代方法和原理；了解急性毒性的分级标准;3.掌握常用局部毒性评价的方法；了解局部毒性评价的替代方法；4.掌握短期重复剂量试验、亚慢性和慢性毒性试验的目的和设计原则。（二）重点与难点1. 急性毒性试验的目的、主要参数、设计原则和试验方法；2. 短期重复剂量试验、亚慢性和慢性毒性试验的目的和设计原则；3. 亚慢性和慢性试验的结果评价。二、学习笔记（一）一般毒性1
2、概念：一般毒性是相对于特殊毒性（通常指致癌、致畸、致突变作用和生殖毒性等）而言的，它是指外源化学物在一定的剂量、接触时间和接触方式下对机体产生综合毒性效应的能力，也称为基础毒性。根据外源化学物接触时间的长短，可分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。2. 一般毒性研究的目的：探讨外源化学物对机体损伤的重要基础资料，为毒作用机制和靶器官毒性研究提供线索；是进行外源化学物安全性评价和危险度评估的重要组成部分，为制定卫生标准、进行卫生决策提供依据。（二）急性毒性试验1. 急性毒性：指人或实验动物一次或24小时内多次接触某外源化学物短期内所产生的毒效应。经口或注射途径染毒“一次”指瞬间给予实验动物染毒；经
3、呼吸道吸入或皮肤染毒时，“一次”接触是指实验动物在特定时间内持续接触外源化学物的过程。“24小时内多次”指外源化学物毒性很低，一次染毒难以达到其规定限量，需24小时内多次染毒。通常24小时内染毒不超过3次，且应有一定的时间间隔，如经口灌胃每次间隔至少4小时。2. 急性毒性试验目的（1）确定一系列急性毒性参数，评价其急性毒性大小。获得以死亡为终点的毒性上限参数（如LD50或LC50），并进行急性毒性分级。（2）通过观察动物中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价外源化学物对机体产生危害性的大小、毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系等。（3）为亚慢性、慢性毒性试验研究和其它毒理学试验的接触剂
4、量设计、观察指标选择提供依据。（4）为毒作用机制研究提供线索。 3. 急性毒性试验常用的参数绝对致死剂量（LD100或LC100）、半数致死剂量（LD50或LC50）、最小致死剂量（minimum lethal dose，MLD，LD01或MLC，LC01）、最大耐受剂量或浓度（maximum tolerated dose/concentration, MTD/MTC）或最大非致死剂量（maximum non-lethal dose/concentration, MNLD，LD0或MNLC，LC0）。以上都是以死亡为终点的参数，也可以得到以非致死性急性毒作用为终点的毒性参数，包括急性毒性LOA
5、EL（观察到最小有害作用剂量）和急性毒性NOAEL（未观察到有害作用剂量）等。4. 急性毒性试验的设计原则（1）充分了解和收集受试物信息。（2）实验动物选择的原则是选择对受试物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致，易于饲养管理，试验操作较简单，容易得到、价格较低廉的动物品系。种属与品系：最好选择两个以上种属的实验动物，一种啮齿类，另外一种是非啮齿类。小鼠和大鼠为啮齿类动物的首选。试验中最好采用常见的品系。一般不要求纯系动物，常选用封闭群杂种动物。性别与年龄：一般选择雌雄各半，雌性动物应为未曾交配和受孕的动物。如果有特殊要求或急性毒性可能存在性别敏感性差异，可选择雌雄动物分别进行试验。一般情况
6、下选用健康成年实验动物。啮齿类动物的体重和年龄相关，可用体重来表示年龄。常见实验动物的成年体重范围是：大鼠180240 g，小鼠1825 g，家兔22.5 kg，豚鼠200250 g，狗1015 kg。实验动物体重差异不要大于平均体重的20%。数量与分组：不同的急性毒性试验方法对实验动物数的要求不一样，一般按照要求进行。试验应设足够的剂量组，一般需37个剂量组（至少3组）。分组按照随机化原则把每只动物随机地分配到不同剂量组。一般按动物体重进行随机分组。检疫与禁食：实验动物选定后，应在检疫室放置57天，剔除异常的实验动物。检疫期与实验期雌雄动物必须分笼喂养，防止交配及受孕。凡经口染毒时，要求试验
7、前动物应禁食，以保证胃内无食物，减少食物对化学物毒性的干扰。大鼠应隔夜禁食；小鼠应禁食4小时；大动物可在染毒前不喂食，染毒后继续禁食34小时，但要保障饮水的供应。（3）受试物剂量的选择：根据与受试物性质近似的化学物毒性资料，以文献中相同的动物种系和接触途径测得的LD50作为该受试物预期毒性中值，然后按照一个合适的间距进行其它剂量组的设计。在设计剂量分组之前，要先确定LD50的方法。急性致死性毒性试验可以不设阴性对照组。（4）染毒途径：尽量模拟人接触受试物的途径和方式，同时考虑化学物的性质和用途。常选用经口、呼吸道和皮肤三个途径。若受试物是注射用药物，其染毒方式可选择不同的注射途径，如静脉、腹腔
8、、肌肉、皮下注射等。（5）毒效应观察：试验观察期限14 天，也可依据毒性反应、症状发生速度延长观察期。观察指标包括：中毒症状；体重变化：死亡和死亡时间；病理检查和其它指标等。5. LD50的计算 （1）LD50的计算方法：LD50的计算有很多方法，要求经过统计分析得到LD50及95%可信限范围。常用的有改良寇氏（Karber）法、霍恩（Horn）法和Bliss 法。（2）经典的急性毒性试验中LD50的局限性：消耗实验动物的数量多；获得的信息有限；测得的LD50值实际上仅是近似值；在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其他检査所提供的深人详细的毒性信息。
9、6. 急性毒性替代试验替代法（alternatives）又称为“3R”法，即优化（refinement）、减少（reduction）、取代（replacement）。常见的急性毒性替代方法包括固定剂量法、急性毒性分级法、上-下移动法及限量试验等。（三）局部毒作用及其评价1. 局部刺激试验：旨在了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，包括眼刺激、皮肤刺激试验。（1）眼刺激试验：眼原发性刺激试验观察终点是眼刺激和眼腐蚀性的程度，包括单次、多次眼刺激试验。眼刺激性指眼前表面接触受试物后引起的眼睛可逆性炎症变化。眼腐蚀性指眼睛前表面接触受试物后引起的眼睛不可逆性组织损伤。一般对皮肤产生刺激的强
10、酸或强碱性物质可免做眼刺激试验。大部分化学物质pH接近中性，其对皮肤和眼的刺激性反应结果可能不一致，对皮肤有刺激的物质不一定引起眼刺激体征，应单独进行眼刺激试验。目前推荐的眼刺激试验方法是Draize眼试验。国内外也探讨使用眼刺激试验的替代方法，目前主要集中在以下几类：离体器官试验；以细胞毒性为基础的试验；基于鸡胚绒毛尿囊膜的试验；基于重组的人角膜组织模型进行的试验。（2）皮肤刺激试验：皮肤原发性刺激试验包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。皮肤刺激是指其皮肤接触化学物后产生的局部可逆性的炎症变化。皮肤腐蚀是指其皮肤接触化学物产生的局部不可逆性
11、组织损伤。不是所有的化学物都适合做皮肤刺激试验，可免于皮肤刺激试验的3种情况：根据结构与活性关系及理化特性推测可能有腐蚀性的物质（如pH2或pH11.5的酸或碱）。在急性经皮毒性试验显示有很强系统毒性的物质。在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kg时仍未产生皮肤刺激体征的物质。Draize皮肤试验现已将其列入化学物安全性评价方法之一。按照皮肤刺激反应评分标准评分，根据各观察时点最高积分均值进行评价，判定皮肤刺激强度。近年来，有几种皮肤刺激试验替代方法通过了欧洲替代方法验证中心（ECVAM）和替代方法验证协调委员会（JCCVAM）的验证。如：单层皮肤细胞培养模型、表皮组织培养模型、器官型
12、人工皮肤模型等。2. 皮肤变态反应试验 皮肤变态反应是一种由免疫介导化学物质的皮肤毒性反应，又称致敏性接触性皮炎。人体反应的特点是瘙痒、红斑、水肿、丘疹、小水疱、大疱，其它物种动物的反应皮肤致敏可能仅见红斑和水肿。皮肤变态反应试验的目的是通过动物试验预测外源化学物经皮肤接触对人类产生皮肤致敏反应的危害。皮肤变态反应试验已有两种类型试验，一种是福氏完全佐剂（FCA）法，另一种是不加佐剂的方法。佐剂法可增强动物对致敏物的敏感性，弱致敏物可用本法检出，有利于预测人类的致敏性。传统的皮肤变态反应试验方法有局部封闭涂皮法（Buehler test，BT）和豚鼠最大值试验法（guinea pig maxi
13、minatim test, GPMT）。目前正在研究的皮肤致敏体外替代方法包括：（1）基于树突状细胞及T细胞等接触性过敏性皮肤诱导相和激发相中的关键免疫细胞的免疫识别的化学致敏过程。（2）建立化学物渗透表皮生发层/真皮层的皮肤模型；（3）角质形成细胞培养模型。（四）短期、亚慢性和慢性毒性试验1. 概念（1）蓄积作用：外源化学物进入机体后，可经代谢产物或化学物原型的形式排出体外，但当外源化学物与机体慢性接触，且进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，外源化学物有可能在体内逐渐增加并潴留，该现象称为外源化学物的蓄积作用。 （2）物质蓄积与功能蓄积：当实验动物多次、反复暴露于外源化学物一定
14、时间后，若能用化学方法测得机体内（或某些组织脏器内）存在该化学物母体或其代谢产物，就称之为物质蓄积。若体内不能测出其原形或代谢产物，却发生慢性毒作用，称为损伤蓄积或效应蓄积（damage accumulation）或功能蓄积（functional accumulation)。功能蓄积是指多次暴露化学物所引起的机体损害累积现象。（3）短期重复剂量毒性：指实验动物或人连续接触外源化学物1430天出现的中毒效应。（4）亚慢性毒性：指实验动物或人连续较长期（约为1/10的生命周期）接触外源化学物出现的中毒效应。啮齿类染毒期限为90天。（5）慢性毒性：指实验动物或人长期接触外源化学物出现的毒性效应。“长
15、期”无统一、严格的时间界限，可以是终生染毒。啮齿类染毒期限至少为12个月。2. 短期、亚慢性和慢性毒性试验的目的（1）了解长期暴露受试物的毒性效应谱、毒作用特点、靶器官和机制。 （2）了解长期暴露受试物毒作用的可逆性。（3） 探讨重复暴露受试物毒作用的剂量-反应（效应）关系，初步确定NOAEL和LOAEL，为制定人类暴露的安全限量提供建议值。（4）亚慢毒性试验可为慢性毒性试验和致癌试验的剂量设计和观察指标的选择提供依据。（5）观察不同动物对受试物的毒效应差异，为把研究结果外推到人提供科学依据。3、短期重复剂量试验和亚慢性试验设计原则（1）实验动物的选择物种和品系：选择对受试物敏感的试验动物。选
16、择的实验动物应是对受试物的生物转化、毒性反应与人类相当或相似的物种。短期重复剂量毒性试验如果是为亚慢性和慢性毒性试验做准备，则应该与慢性毒性试验动物一致。一般要求两种实验动物，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。性别、年龄和数量：通常要求实验动物雌雄各半，特殊研究（如研究化学物的性腺毒性或生殖毒性）可选用单性别动物。一般选择刚断乳的健康动物，啮齿类动物不超过6周龄，大鼠100 g左右，小鼠15 g左右；犬通常选用46个月（一般不超过9个月）的幼犬。小动物（大、小鼠）每组不少于20只，大动物（犬、猴）每组不少于6只。各试验组和对照组动物数应相同，体重相近，同组动物体重相差不超过平均体重的10%，组间
17、平均体重不超过平均体重的5%。实验动物微生物要求和饲养条件：应该选择清洁级以上等级的实验动物，饲养在屏障环境内，有充足的营养的饲料、清洁的饮水和消毒的垫料。严格控制昼夜交替。（2）染毒途径与染毒期限：染毒途径应当尽量选择和人类接触途径相似的方式，并与预期进行的慢性毒性试验的接触途径一致。一般经口、呼吸道和皮肤染毒三种途径较多。短期重复剂量毒性试验期限是28天，最多不超过32天。亚慢性毒性试验通常是13个月。（3）试验分组与剂量选择：试验通常至少要设3个剂量组和1个阴性对照组，必要时再加一个溶剂对照组。受试物剂量选择根据LD50和人实际摄入的剂量确定。一般高剂量组应能引起明显的毒性，动物不出现死
18、亡或少量动物死亡（少于10%）；中剂量组应能观察到较轻微的中毒症状，约相当于LOAEL；低剂量组应无中毒反应或只观察到极轻微的反应，相当于NOAEL。较理想的组距以310倍为宜，最低不少于2倍。（4）毒作用观察：在染毒过程和结束时，要全面、系统、深入地观察检测实验动物。一般在短期重复剂量试验中，观察指标的范围应适当放宽，即进行较为全面、系统的观察，以免遗漏重要的信息。而在其后的亚慢性毒性试验中，可重点观察意义较大而敏感的终点和毒性损伤指标。包括： 一般观察：包括动物体重、食物利用率、中毒症状、眼部检测等； 生化检测：包括血液学指标、血液生化学指标、尿液指标等项目；系统解剖和病理组织学检查；其它
19、特异性指标。（5）观察时间：试验期在3个月以内时，通常在最后一次给药后24小时和恢复期结束时分别做一次全面的检查，必要时在试验中检测一次有关指标。短期重复剂量毒性试验恢复期为停止染毒后14天，90天亚慢性毒性试验恢复期为停止染毒后28天。试验期为3个月以上的，可在试验中期处死少量高剂量组和对照组动物，进行全面检测有关指标。4. 慢性毒性试验的设计原则（1）慢性毒性试验的设计实验动物的选择：选用的实验动物应该与短期重复毒性试验和亚慢性毒性试验相同。最好选择两个物种实验动物（啮齿类和非啮齿类），常用大鼠和犬，雌雄各半。一般选择初断乳动物，大鼠出生34周，体重约5070 g，小鼠出生后3周，体重约1
20、015 g。每组动物数量应以统计学方法处理可靠性数据为依据。试验分组与染毒剂量：至少要设3个剂量组和1个对照组，必要时另设1个溶剂对照组。高剂量组应能观察到明显的毒性效应，但不引起过高的死亡率，低剂量组应无中毒效应（相当于阈剂量或NOAEL），中剂量组在二者之间，引起轻度的毒性效应。较理想的组距以24倍为宜，不应超过10倍。染毒途径与染毒期限：染毒途径以人类实际使用和接触的途径为选择依据，与短期重复毒性试验和亚慢性毒性试验相同。试验期限一般为12个月，具体期限应根据试验具体要求和所选用的动物种属来定。如果要监测由受试物所致的毒性反应的可逆性、持续性和延迟效应，一般应该在停止染毒后至少观察28天
21、，但不宜超过主体试验期限的1/3。观察指标：与短期重复毒性试验和亚慢性毒性试验的指标基本相同，病理检查应为重点，根据亚慢性毒性试验结果重点选择敏感、特异性指标，适当增加能反映受试物特异性作用的其他指标。5. 慢性毒性试验注意事项慢性毒性试验由于试验周期长，动物消耗大，需要投入大量的人力和物力，故实验设计中要周到、全面。实验室质量控制是保障试验成功、实验数据的科学性和准确性的先决条件。慢性毒性试验应该遵循良好实验室规范（Good Laboratory Practice，GLP）进行管理。包括以下几个方面（1）实验设计合理；（2）动物选择与管理；（3）受试物的配置和管理；（4）试验操作；（5）检测
22、条件的控制等。 6. 亚慢性和慢性毒性的评价对亚慢性或慢性毒性试验结果的评价应包括三个方面：明确化学物的毒效应；确定毒效应的敏感指标；确定亚慢性或慢性毒性的NOAEL和LOAEL，对受试物亚慢性或慢性毒性的毒性进行评价。另外，可根据急性阈剂量（Limac） 和慢性阈剂量（Limch）计算慢性毒作用带（Zch）。对于易挥发的液态化合物，可计算慢性吸入中毒可能指数（Ich=C20/ Limch，C20为20时饱和蒸汽浓度）来评价发生慢性吸入中毒的危险性。对亚慢性和慢性毒性试验的结果分析，需要应用相应的统计学方法，结合毒理学相关知识对其结果综合评价、分析，才能得出受试物毒性的准确结论。当某剂量组与对
23、照组之间差别有统计学意义时，首先应该判断该差异是与受试物有关还是偶然关联，可通过综合分析（1）剂量-反应（效应）关系；（2）时效关系；（3）组间差异；（4）重现性；（5）相关指标的变化；（5）差异的有效性；（6）性别差异；（7）历史对照的作用等方面，来确认染毒组与对照组的差别是否有生物学意义。三、英汉名词对照一般毒性 general toxicity基础毒性 basic toxicity急性毒性 acute toxicity急性毒性试验 acute toxicity test最小致死剂量 minimum lethal dose，MLD最大耐受剂量 maximum tolerated dose/
24、concentration, MTD/MTC最大非致死剂量 maximum non-lethal dose/concentration, MNLD/MNLC靶器官 target organs替代法 alternatives优化 refinement减少 reduction取代 replacement微观毒性测试系统 the microtoxic test system固定剂量法 fixed dose procedure急性毒性分级法 acute toxic class method上-下移动法 up/down method限量试验 limit test急性毒性进行分级 acute toxici
25、ty classification全球化学品统一分类和标签制度 Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals，GSH局部刺激试验 local irritation test眼原发性刺激试验 eye primary irritation test眼刺激性 eye irritation眼腐蚀性 eye corrosion牛角膜浑浊和渗透性试验 Bovine Corneal Opacity and Permeability，BCOP离体兔眼试验 isolated rabbit eye test，IRE离体
26、鸡眼试验 Isolated Chicken Eye，ICE中性红摄取试验 neutral red uptake assay，NRU中性红释放试验 neutral red release assay，NRR红细胞溶血试验 red blood cell haemolysis test，RBC正常人表皮角质形成细胞 normal human epidermal keratinocytes, NHEK鸡胚绒毛膜尿囊膜试验 hens egg test on the chorio-allantoic membrane, HET-CAM绒毛膜尿囊膜血管试验 chorioallantoic membrane
27、vascular assay，CAMVA绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验 chicken chorioallantoic membrane trypan blue staining，CAM-TB试验最大平均分值 maximal average score，MAS皮肤原发性刺激试验 skin primary irritation test皮肤刺激 dermal irritation皮肤腐蚀 dermal corrosion皮肤变态反应 skin sensitization皮肤变态反应试验 skin sensitization test局部封闭涂皮法 buehler test，BT豚鼠最大值试验法 gu
28、inea pig maximinatim test, GPMT诱导接触 induction exposure激发接触 challenge exposure蓄积作用 accumulation物质蓄积 material accumulation损伤蓄积 damage accumulation功能蓄积 functional accumulation蓄积系数 accumulation coefficient, K短期重复剂量毒性 repeat dose toxicity亚急性毒性 subacute toxicity亚慢性毒性 subchronic toxicity慢性毒性 chronic toxici
29、ty食物利用率 feed efficiency脏器系数 relative organ weight慢性毒性试验 chronic toxicity test良好实验室规范 Good Laboratory Practice，GLP四、复习思考题（一）名词解释（每章10个左右，至少5个；应有英文名词或常用的缩略语）1. 一般毒性2. 急性毒性3. 蓄积作用4. 物质蓄积5. 功能蓄积6. 蓄积系数7. 短期重复剂量毒性8. 亚慢性毒性9. 慢性毒性10. 食物利用率11. 脏器系数12.“3R”法13. 眼刺激14. 皮肤腐蚀（二）A1型选择题（单句型最佳选择题，每章20题左右，至少10题）（每题下
30、面有A、B、C、D、E五个备选答案，请从中选择一个最佳答案！将答案填写在题目后面的括号中和后面的题解析中！）1. 外源化学物的一般毒性包括 （ D ）A .致癌作用B. 致畸作用C. 致突变作用D. 慢性毒性E. 生殖毒性2. 下列选项对急性毒性试验的描述不正确 （ B ）A. 可一次或24小时内多次染毒B. 以动物死亡为唯一观察终点C. 是认识和探讨外源化学物对机体毒作用的第一步D. 可获得LD50E. 可观察到急性毒性LOAEL3. 急性毒性试验观察期限为 （ C ）A. 24小时B. 1周C. 2周D. 1个月E 高剂量组动物全部死亡的时间4. 急性毒性试验实验动物选择原则，不正确的是
31、（ E ）A.对受试物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致；B. 易于饲养管理；C. 试验操作较简单；D. 容易得到；E. 品系纯正 5. 急性毒性试验实验动物选定后，处理不正确的是 （ D ）A. 应在检疫室放置57天；B. 雌雄动物必须分笼喂养；C. 应剔除异常的实验动物；D. 经口染毒时，要求所有动物试验前应隔夜禁食812小时；E. 经口染毒时，染毒后应继续禁食34小时6. 替代试验的原则是 （ C ）A. 优化试验方法和技术；B. 减少受试动物的数量；C. 减少动物试验的成本；D. 减少受试动物的痛苦； E. 取代整体动物试验；7. 下列描述不正确的是 （ A ）A. 对皮肤产生刺激的物质可免做眼刺激试验；B. 可对皮肤产生刺激的强酸或强碱性物质免于做皮肤刺激试验；C. 在急性经皮毒性试验中显示有很强系统毒性的物质可免于做皮肤刺激试验；D. 在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kg时仍未产生皮肤刺激体征的物质可免于做皮肤刺激试验；E. 根据结构与活性关系及理化特性推测可能有腐蚀性的物质（如pH2或pH11.5的酸或碱）可免于做眼刺激试验；8. 短期、亚慢性和慢性毒性试验之间存在相互联系，下列描述不正确的是 （ D
