1、中标的国家自然基金标书docx项目类别申报学科代码1科学部编号AC010704国家自然科学基金申 请 书项目名 称迷走反射调节胰腺分泌的神经传递机制研究申 请 者所在单位邮政编 码通讯地 址电 话传 真电子信箱(Email):申请日 期：2002年3月10日国家自然科学基金委员会1997年制填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请 办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达 要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。 第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本， 复印时用 B5 复印纸，于左侧装订成册。 第三页起各栏空格不够时，
2、请自行加页。一式六份（至少一份为原 件），由所在单位审查签署意见后， 按申报学科投送国家自然科学基 金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治 区）科委一份原件。三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别 和申报学科代码 1 由申请者填写。四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为 项目组成员参加研究：在读（含在职）研究生已离退休的科研人员申请单位的兼职科研人员五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请 （含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含 重点项目、重大项目） ，不得超过两项。六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报
3、送一个学科。七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的 专家名单（姓名与单位， 3 人以内），密封于信封中，钉在申请书原 件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科 学部将对此信息保密。八、国家自然科学基金委员会地址： 北京市海淀区双清路 83 号， 通讯地址：北京 8610 信箱。邮政编码： 100085、简表研 究 项 目名称中 文迷走反射调节胰腺分泌的神经传递机制研究英文The mechanism of the vago-vagal reflex circuit in mediating pancreatic secretion evoked by lumin
4、al factors类别A.自由申请 B.高技术探索 C.青年 D.地区咼技术探索 项目主题号E.重大 F.重点 H.专项A申报 学科名称1消化生理学名称2消化系内科学A.基础研究B.应用基础A代码1C010704代码2C03030204申请金额2400力兀起止年月2003年1月至 2005年12月所用实验室A.国家重点 B.部门开放实验室编号研 究 内 容 和 意 义摘 要通过.细胞.内一逆一向.追踪.二迷-走感觉.胞.电.理.记.录.二结.胰.腺.分.泌功.能.二证.实.肠.受刺.后.迷.走一神经一通.2过旦u和.将.信.息一丄传孤.束-核一迷一走一背一核一通.丄及一调一节一胰.分一泌一-
5、阐一明一迷一走一运一动.经一元一接一受.特一定一刺一激一后.兴一奋一有一特一定一神一经一递一质.胰一腺一内一神-经一，-调一节一特.!定的-胰一腺一内外.分.泌.功.能.从.而.确.定.从.迷.走.感.2神.经.元.到孤束核及一迷.走背核到胰腺的神经一通O词 题 主O1) 盼 T 空 间 之 词 题 、干2 个 三文 中神一经一递一质一传一迷一走一反一射胰一腺一分一泌一n匚简表填写要求一、 简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最 新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题
6、号填写，申请其重点项目时项目类别也填写 B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目” 。二、 凡选择性栏目，将相应提示符 A、B等之一填入该栏的右下角。三、 部分栏目填写要求：项目名称一一应确切反映研究内容和范围，最多不超过 25个汉字（包括标点符号）。基础研究一一指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究一一指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科一一申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额一一以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月一一起始时间从申请的次年1月算
7、起。终止时间为完成年度的 12月。所用实验室一一系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准 的开放实验室。所在单位名称及代码一一按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得 填“中科院西安光机所”或“西安光机所” 。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七O所。首次申请国家自然科学基金的单 位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数一一指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位 （合作者所在单位），以阿拉伯数字表示。项目组主要成员 一一指在项目组内对学术思想、 技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人
8、员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义 摘要与主题词均录入软盘。2、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义； 对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题， 论述其应用情景。餐后胰腺分泌是食物消化吸收过程中的重要组成部分，目前认为这一过程主要由内分 泌激素胆囊收缩素(CCK)及迷走-迷走反射作用于胰腺的迷走神经胆碱能节后神经调节 1-3。但餐后迷走神经信号的上传、中枢整合后控制胰腺分泌信号的下传神经通路及在这一 通路中参与的神经递质还未阐明
9、，病理研究证实迷走神经初级传入纤维位于肠上皮以下粘 膜固有层内，提示肠道接受刺激后并不直接作用于迷走神经传入纤维，而通过间接途径起 作用。5羟色胺(5-HT )为传递内脏感觉的神经递质，美国 Michigan大学胃肠肽研究中心报道迷走神经初级传入纤维含有大量 CCK-A及5-HT3受体，肠道内的刺激，如碳水化合物、高渗盐水及粘膜磨擦等，可导致肠粘膜嗜铬细胞( EC)释放5-HT，继而作用于迷走传入神经末梢的5- HT3受体，引起迷走反射主导的胰腺分泌 4-6。迷走感觉神经元细胞内电生理记录进一步发现 5-HT与CCK可能协同作用刺激迷走神经传入纤维。然而这种信号如何上传以及参与其传递过程的神经
10、递质仍不清楚。迷走神 经节(vagal nodose ganglia )及孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS )为迷走传入的重要 部位。迷走神经节及孤束核内均有多种神经递质，研究发现谷氨酸盐( glutamate, Glu)及P物质(substanee P, SP)在迷走神经节内合成并释放至孤束核 8，而起兴奋性神经递质作用。Glu及SP是否参与肠道刺激后迷走神经的信号传入尚未见报道。 我们推测肠道刺激后，肠道EC细胞释放5-HT , 5-HT作用于迷走初级传入神经末梢的 5HT3受体，兴奋迷走传入神经，将信号传至迷走神经节， 迷走神经节利用 Glu及SP作
11、为兴奋性神经递质将信号传至孤束核。因此，在本研究的前半部分，我们将通过肠腔刺激观察迷走神经节内兴奋性神经 元神经递质Glu及SP的表达，并通过神经元细胞内电生理记录证实 Glu及SP作为兴奋性神经递质参与信号上传。 同时孤束核内 Glu及SP受体表达增加，电生理记录确定兴奋性神经元，通过神经元染色证实迷走传入神经将 Glu主SP作为兴奋性递质将外因刺激的信号传至中枢。中枢对胰腺分泌功能的调节主要是通过迷走运动背核( dorsal motor nucleus, DMN )发 出的副交感 运动神 经起作用。以往 零星的研究发现DMN 微量注 射甲状腺素激素 (thyrotropin-releasi
12、ng hormone, TRH )能刺激胰腺分泌 9，而胰多肽 (pancreatic polypeptide, PP)则能抑制胰腺分泌10。脑内注射生长抑素(somatostatin, SS)、钙调基因相关肽(calcitonin gene-regulated peptide, CGRP)及胰高血糖素类似肽( Glucagon-like-peptide-1, GLP-1 )亦对 胰腺分泌有抑制作用11-13。但各种中枢神经递质调节胰腺分泌的作用通路，它们对迷走传 出神经功能的调节、对胰腺内神经元的调控，以及特定神经递质对胰腺分泌的特异性调节 作用尚未见报道。DMN的迷走传出神经对胰腺分泌的调
13、控是非常复杂的，其一方面接受 NTS的传入信息，另一方面也接受高级中枢的控制 14，此外，血循环中一些内分泌因素可通过血脑屏障薄弱处直接作用于 DMN 15。我们认为，DMN迷走传出神经对胰腺功能的调节是众多兴奋性神经递质与抑制性神经递质综合作用的结果，迷走神经传出纤维作用于胰腺内神经，后者综合各种中枢信息，调节胰腺功能。研究发现 DMN迷走传出神经有多种神经递质，如乙酰胆碱、 NOS及各种神经肽(VIP、NPY、GRP)等16，因此，我们推测特定的刺激可以作用于某一组迷走运动神经元，它们有特定的神经递质，这些传出纤维作 用于具有不同的特有神经递质的胰腺内神经元，从而调控不同的胰腺功能。综上所
14、述，虽然以往的研究已经发现肠道刺激后，肠粘膜 EC释放5-HT，作用于迷走传入神经末梢5-HT3受体最终引起胰腺的分泌，但这种刺激上传通路及参与的神经递质均 不明确。DMN内微量注射某些神经递质已证实对胰腺的分泌功能有兴奋或抑制作用， 但中枢传出对胰腺分泌的调控通路及其相关的神经递质尚不清楚。因此，我们设计了本研究， 希望能初步确定肠道刺激引起胰腺分泌的一个完整的神经通路，即肠道刺激激发迷走传入 冲动到NTS，DMN传出冲动到胰腺调节胰腺分泌功能。这一研究将证实存在脑-胰通路(Brai n-Pa ncreas In teraction )的假说，丰富对胰腺分泌调节机制的认识，对胰腺疾病的救 治
15、具有重要的意义。参考文献1.Li Ying, Owyang C. Endogenous cholecystokinin stimulated pancreatic enzyme secretion via a vagal afferent pathway. Gastroenterology, 1994;107(2):525-5312.Li Ying, Hao Y, Owyang C. High-affinity CCK-A receptors on the vagus nerve mediates CCK-stimulated pancreatic secretion in rats. Am
16、J Physiol, 1997;273(3Pt1):G679-G6853.Li Ying, Owyang C. Pancreatic secretion evoked by cholecystokinin and non-cholecystokinin-dependent duodenal stimuli via vagal afferent fibers in rat. J Physiol, 1996;491(3):773-7824.Li Ying, Hao YB. Zhu JX, Owyang C. Serotonin released from intestinal EC cells m
17、ediate luminal non-CCK stimulated pancreatic secretion in rats. Gastroenterology, 2000;118(6):1197-12075.Li Ying, Hao YB, Zhu JX, Owyang C. Intestinal serotonin acts as a paracrine substance to mediate pancreatic secretion stimulated by non-CCK dependent luminal factors. Am J Physiol, 2001;281(4):G9
18、16-G9236.Zhu JX, Wu XY , Owyang C, Li Ying. Electrophysiological evidence that intestinal 5-HT acts as a paracrineto mediate vagal signal transmission evoked by luminal factors in the rat. J of Physiol, 2001;530(3):431-4427.Li Ying., Wu YX, Owyang C. Serotonin and cholecystokinin synergistically sti
19、mulate at vagal primary afferent neurons. Gastroenterology, 2001;120(5):A38328.Granata AR, Sved AF, Reis DJ. In vivo release by vagal stimulation of L-(3H) glutamic acid in the nucleous tractus solitarius preloaded with L-(3H) glutamine. Brain Res Bull, 1984;12(1):5-9.9.Okumura T, Taylor IL, Pappas
20、TN. Microinjection of TRH analogue into the dorsal vagal complexstimulates pancreatic secretion in rats. Am J Physiol, 1995;269(3Pt 1): G328-3410.Okumura T, Pallas TN, Taylor IL. Pancreatic polypeptide microinjection into the dosal motor nucleus inhibits pancreatic secrtion in rats. Gastroenterology
21、, 1995;108(5): 1517-2511.Li Ying, Jiang YC, Owyang C. Calcitonin gene-regulated peptide inhibits pancreatic exocrine secretion by modulation of vagal parasympathetic outflow. Am J Physiol, 1998;275(5Pt1): G957-G96312.Li Y ing, Owyang C. Somotostatin inhibits pancreatic enzyme secretion by a central
22、vagal site of action. AmJ Physiol, 1993;265(28): G251-G25713.Li Y ing, Zhu JX, Rillamas E, Nozu F, Owyang C. Glucagon-like-peptide-l acts via dorsal vagal complex to inhibit pancreatic enzyme secreation. Gastroenterology, 1998;114 (4): G474114.Li Ying, Wu XY, Owyang C. Hypothalamic regulation of pan
23、creatic secretion is mediated by centra cholinergic pathway. Gastroenterology, 2000;118(4): A13115.Rogers RC, McTigue DM, Hermann GE. Vagal control of digestion: modulation by central neural and pheripheral endocrine factors. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 1996;20(1):57-6616.Wang J, Zheng H
24、, Berthoud H. Functional vagal input to chemically identified neurons in pancreatic ganglia as revealed by fos expression. Am J Physiol, 1999;277(5Pt1):E958-E964三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标肠道接受刺激后，迷走感觉神经利用谷氨酸盐 (Glu)、P物质(SP)作为神经递质肠道接受刺激后，迷走感觉神经通过 Glu、SP将信息传递到孤束核，孤束核内 Glu受体及SP受体增加，亦参与这一迷走传入通路肠道接受刺激后
25、，迷走运动背核通过 SP、神经肽(neropeptide, NPY)兴奋有特定神经递质的胰腺内神经元，刺激胰腺分泌；并通过生长抑素 (SS)作用于有特定神经递质的胰腺内神经元，抑制胰腺分泌研究内容肠道刺激后，迷走感觉神经神经递质传递机制1利用c-Fos的表达确定肠道接受各种刺激 (碳水化合物、高渗盐水、 5-HT)后，迷走神经节(vagal no dose gan glia)内的迷走感觉神经元2通过免疫组化双重染色， 观察c-Fos阳性神经元Glu及SP的表达，说明肠道刺激后迷走感觉神经 Glu及SP表达增加3通过迷走感觉细胞的电生理记录及细胞内神经微粒 (n eurobiot in)标记，确
26、定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元，联合细胞内神经微粒标记及免疫组化双重染色确定这些迷走感觉神经元利用 Glu及SP作为神经递质孤束核对肠道刺激的反应1利用c-Fos的表达确定肠道接受各种刺激 (碳水化合物、高渗盐水、 5-HT)后，孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)内的迷走感觉神经元2通过免疫组化双重染色，观察 c-Fos阳性神经元Glu受体及SP受体的表达，说明肠道刺激后NTS迷走感觉神经 Glu受体及SP受体表达增加3通过NTS内迷走感觉细胞的电生理记录及细胞内神经微粒标记，确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元，联合细胞内神经微粒标记及免疫组化双重染
27、色确定这些迷走 感觉神经元Glu受体及SP受体表达增加，说明迷走神经通过 Glu及SP将外周刺激传入中枢4a4NTS内微量注射Glu受体阻断剂或 SP受体阻断剂后，观察胰腺分泌功能，说明阻断 这一上传通路，中枢对胰腺分泌的调节不能下传肠道刺激后迷走运动背核对胰腺分泌的调节1肠道接受刺激后，胰腺内注射荧光标记霍乱毒素 B（CTB），逆向追踪迷走运动背核（dorsal motor nucleus, DMN）内CTB阳性神经元（支配胰腺神经元）。利用双重免疫荧光标记观察CTB阳性神经元c-Fos、乙酰胆硷转移酶（ChAT）、Glu受体及SP受体的表 达，说明DMN内支配胰腺的神经元可被肠道刺激激活2
28、通过微量注射法，脑室内或 DMN内注射NPY受体拮抗剂、SP受体阻断剂、NPY、SP、SS,通过迷走神经胰腺枝的电生理记录，确定上述神经递质可作用于 DMN，调节迷走神经到胰腺的传出信号，调节胰腺的分泌功能3肠道接受刺激后，DMN内微量注射SP、NPY、SS,观察胰腺内迷走神经元 （c-Fos阳性），利用双重免疫荧光标记，观察 c-Fos阳性神经元ChAT、胃泌素释放肽等神经递质的表达，证实特定的迷走神经元受到刺激后， 兴奋具有特定神经递质的胰腺内神经拟解决的关键问题迷走神经节迷走感觉神经元内电生理记录迷走神经节迷走感觉神经元内神经微粒注射孤束核内迷走感觉神经元内电生理记录孤束核内迷走感觉神经
29、元内神经微粒注射迷走运动背核内微量注射法迷走神经胰腺枝电生理记录双重免疫荧光标记4b 2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法利用c-Fos表达阳性确定迷走神经节、孤束核、迷走运动背核及胰腺内迷走感觉神经利用免疫组化双重染色研究迷走神经节内 c-Fos阳性神经元Glu、SP等神经递质表达利用荧光免疫组化双重染色研究孤束核内 c-Fos阳性神经元Glu受体及SP受体表达通过迷走感觉细胞的电生理记录， 确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元， 免疫组化双重染色确定这些迷走感觉神经元利用 Glu及SP作为神经递质。荧光免疫组化双重染色研究孤束核内被兴奋神经元 Glu受体及SP受体表达胰腺内注射荧光标记霍乱毒素 B(CTB)，逆向追踪迷走运动背核内 CTB阳性神经元(支配胰腺神经元)。利用双重免疫荧光标记观察 CTB阳性神经元 c-Fos、乙酰胆硷转移酶(ChAT)、Glu受体及SP受体的表达通过微量注射法， 脑室内或DMN内注射NPY受体拮抗剂、SP受体阻断剂、NPY、SP、 SS,通过迷走神经胰腺枝的电生理记录，确定上述神经递质可作用于 DMN，调节迷走神经到胰腺的传出信号，调节胰腺的分泌功能通过迷走运动背核内微量注射 SP、NPY、SS,利用双重免疫荧光标记，观察胰
