1、细胞工程动物组织和细胞的培养第4节 动物细胞培养一 动物细胞培养类型(一)细胞原代培养1.取材分离 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水BSS） ，冲洗数次。AdultEmbryoEgg取材分离DissectionEnzyme DigestionCell CultureFinely choppedPrimary ExplantsFurther dissectionif necessaryOrgan Culture2.组织消化：是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加人3050倍体积的0.25浓度胰蛋白酶；消
2、化：37水浴内消化3060分钟。过滤：如果大部分细胞已经分散，终止消化，以不锈钢筛过滤(100m）滤除未被消化的组织块。离心：8000rpm/min离心5分钟，弃上清液,沉淀为细胞。漂洗；Hanks液漂洗两次，每次23分钟，加人营养液 。3.细胞计数细胞悬液制成后，需要计数悬液中细胞的浓度，通常以细胞个数ml表示。检查方法如下：1）在干净的离心管中加人数滴细胞悬液，再加人6.4台盼蓝（trypan blue）1滴，混匀后静置23分钟；2）将计数板（如图）平放在显微镜台上，在盖片边缘加人l2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖片间的空间，勿留气泡，勿使盖片漂浮；3）显微镜下记录计数板四角四个
3、大格中的细胞总数，原则是: 染蓝的细胞不数（死细胞），无色的细胞计数（活细胞），一团细胞按一个细胞计数。计数时要注意：如果细胞团数超过10，说明消化过程进行的不充分；如果细胞数少于20-50个说明稀释的不当.(二)传代培养当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面。这时需要对其分离重新培养，这一操作过程称之为传代。有8090%或刚刚全部汇合的细胞，是传代的理想时期。具体方法如下：1)吸出培养瓶内旧培养液；2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底对细胞进行消化；3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去残留的消化液。4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度；
4、5）重新接种培养Tissue culture flasks T-flasks Petri dishes(三)微载体培养（microcarrier culture)1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径为60-250m的微珠。最初使用的材料为二乙基氨基乙基交联葡聚糖A50后经改进，用带不同基团的葡聚糖（dextran）交联成几种大分子，以利于细胞的贴壁及生长。目前使用的dextran I、三种型号都属于交联葡聚糖为基质的微载体，每种微载体所带基团各不相同。微载体培养细胞的具体步骤1）选择合适的微载体类型先用少量三种微载体做细胞培养试验，一定时间内计算细胞贴壁数量
5、，比较细胞用量、微载体用量，以此选出适当的微载体。（2）浸泡水化及消毒在玻璃容器中加人适量的微载体，加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小时以上，轻轻搅动。搅动速度5070rpmmin为好。高压蒸汽灭菌，（3）接种根据细胞类型决定接种浓度，例如，人成纤维细胞的适宜接种浓度为10 cells微载体；非洲绿猴肾细胞（vero）为5cells微载体。接种要达到一定浓度，但过高也不利。培养中的搅拌转速：提供均相培养环境防止微载体集聚促进汽液交换30-120r/min（4）培养观察 显微镜直接观察微载体上细胞生长 将微载体上的细胞消化下来计数并计算其浓度: 取1ml均匀的培养细胞样品，待微载体沉淀后吸去上清液
6、，加PBS液清洗。加胰蛋白酶37消化15min，吸出消化液后加到培养液中，过滤分离微载体，离心弃上清夜，保留细胞沉淀；加美蓝染液2ml，血球计数器计数，计算细胞浓度。（5）消化 传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体，通常采用酶消化法。消化步骤： 停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液，用含0.25EDTA的PBS（pH6.7），按50l00mlg微载体量清洗微载体，弃EDTA-PBs。 加人胰蛋白酶一EDTA，37搅动消化15min 加人含10%血清的培养液，终止消化作用。（6）分离细胞 脱离微载体的细胞培养液放人容器， 离心沉淀微载体（400rmin，2分钟）收集细胞。 还可用过滤方法，采用
7、直径100m孔径的尼龙网、不锈钢网等可将细胞与微载体分离开。（7）传代培养 微载体上分离下来的细胞可进一步做微载体传代培养。 可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加人一些新的微载体以增大培养体积。 另一种放大培养方法：也可在微载体长满细胞后直接加人微载体,更换培养基。(四)微囊化培养（microcapsule culture） 微囊是用一种人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质包裹在其中不能逸出； 细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护。 减少了搅拌对细胞产生的剪切力 由于环境的改善，细胞得到很好的生长，代谢产物浓度增加，纯度提
8、高。 制备动物细胞微囊所用的材料，主要是海藻酸（ALG）和多聚赖氨酸（PLL）. 海藻酸和多聚赖氨酸分子量的大小及其溶液的浓度；细胞与海藻酸钠混合的时间；溶液的pH，温度等都会影响微囊膜直径的大小.微囊制作1）分离好的细胞悬浮在1.01.2的海藻酸钠液中，细胞终浓度达到1107cellsml；2）细胞悬浮液经微囊发生器制成微滴，将微滴加人1.3%CaCl2溶液后成凝胶球，10分钟后，去除上清收集胶球;3）加人0.05的聚赖氨酸，微球胶体颗粒表面包裹一层膜. 例1:应用微囊化方法培养杂交瘤细胞时，微囊膜孔径大小控制截留8104D以内的分子量，免疫球蛋白IgG（杂交瘤细胞产生的单抗）的分子量为1.
9、5105D。 当细胞生长稳定，达到6107 cellsml培养液时，抗体的产量可高达1.5mgml。 例 2:将分离的胰岛细胞培养13天后，按1.7510 3cellsml浓度悬在1.5海藻酸钠溶液中制成微囊，按4103个微囊只老鼠，腹腔植人培养一段时间后，老鼠血糖下降,保持了一年。二、影响动物细胞体外培养的环境因素1、培养温度 哺乳类细胞的最适培温度37，鸡细胞在3942，昆虫类细胞2528，冷水鱼细胞23，温水鱼26。细胞对低温的耐受力强于高温，有人做过实验：放在45温度下，1小时死亡；放在4142下，1024小时细胞退化或死亡；放在在2535时，细胞缓慢生长，放在4下几小时后再放人37下
10、培养，细胞仍能生长。2、培养液的pH值大多数动物细胞都适合在pH7.2pH7.4范围内生长.原代培养细胞对pH值要求较严，传代培养细胞对pH值要求较宽。细胞对偏酸环境的耐受性要强于偏碱环境。通常是在培养液中加人一定量的磷酸缓冲液（PBS），保持培养液的pH值相对稳定。或用羟乙基呱嗪乙烷磺酸（HEPES）氢离子缓冲液。3、溶氧水平 细胞生长离不开氧气的供应，培养初期细胞数量少，可以控制较低水平的溶氧量。 随着细胞数量的增多，营养物质的消耗，加大溶氧量。对大多数动物细胞来说，培养过程中对氧的消耗速率范围是：4.510124.810 12 g（cellh）。4、培养液渗透压培养液的渗透压是指用以阻止细胞水分子通过半透膜进人培养液的压力，其大小与其浓度成正比。 原代培养的细胞一般对渗透压的波动较敏感，而细胞株和细胞系则耐受性较大。 培养液需要一定的渗透压。
