1、用紫外光谱分析测定饮料中咖啡因的含量用紫外光谱分析测定饮料中咖啡因的含量摘要 咖啡因广泛应用于当今许多碳酸饮料和能量饮料中。随着可乐饮料如可口可乐，百事可乐等在全世界的风靡，各种可乐饮料已经成为人们饮食当中摄取咖啡因次数较高的一个重要来源，但大量或长期摄取咖啡因有损人体的健康。因此,各国对饮料中咖啡因的含量都做出了相应的规定和限制。现有的咖啡因分析方法中，光谱分析方法简单，直接，但很难避免样品基质和其它物质的干扰，所得结果往往有较大误差；色谱及色谱质谱联用分析方法准确、灵敏度高，但往往样品前处理步骤繁琐，需要使用大量的有机溶剂，分析时间较长，所需的分析费用也相对较高。因此，发展一种简便、有效、
2、经济、环保的分析方法用于饮料中咖啡因的日常质量控制和法规检测显得尤为重要。 本论文采用紫外光谱分析方法测定饮料中咖啡因的含量。该方法简单快速、稳定、准确、灵敏度高、干扰物排除能力强，同时也是对所学知识的一种巩固运用。关键词：紫外分光光谱法；饮料；咖啡因；测定； 前言 咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1，3，7三甲基黄嘌呤，为白色无臭味苦的发亮针丝状或粉末结晶。熔点为 234 -238 ，178升华，能溶于乙醚、丙酮、氯仿、水，微溶于石油醚。以往咖啡因常采用容量法，因操作复杂不太理想。实践证明本方法简单快速好，可用于可乐型饮料中咖啡因的测定。 咖啡因具有提神醒
3、脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准。美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200mg/L，南斯拉夫规定不得超过120mg/L，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过150mg/Kg，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。 紫外分光光度法是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法。其方法简单、快速、准确。最低检出浓度：紫外法对可乐型饮料为3mg/L；对咖啡、茶叶及其固体制品为5mg/100g；对咖啡和茶叶的液体制品为5mg/L。一 紫外可见分光光度计概述（一） 分光光度法
4、原理分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，
5、红外光区。当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I，则溶液的透光率T为：I/I0根据朗伯（Lambert）-比尔（Beer）定律: A=abc 式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm3）， a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，当固定溶液层厚度L和吸光系数时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长，然后以此波长的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液
6、的吸光度A，作出A-c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。上述方法是依据标准曲线法来求出未知浓度值，在满足要求（准确度和精密度）的条件下，可以应用比较法求出未知浓度值。（二） 分光光度仪构成 依据分光光度法测量原理，把比较法应用到仪器之中浓度直读功能。用标准溶液将仪器调整好，再测定样品时，直接显示样品浓度值。1 辐射源自动检测仪器的核心组成部分，通过运行检测程序和链接显示器以及其他外部设备，实现在线自动检测、数据储存于采集、远程控制等。辐射源必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤
7、钨灯（波长范围3502500纳米），氘灯或氢灯（180460纳米），或可调谐染料激光光源等。2 进样装置单色器蠕动泵和九通阀实现多个反应试剂及样品的进液，计量装置控制反应试剂及样品进样量。单色器它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。3 光源发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。（稳压装置）4 反应池（吸收池） 检测时的化学反应均在反应池内进行，反应结束后被测试液将由检测系统将信号传输并分析。因此，反应池有两个作用：一是作为分光光度检测的化学反应装置；二是作为分光光度检
8、测的比色皿。玻璃比色皿能吸收紫外光，仅适用于可见光区；石英比色皿不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。试样容器，又称吸收池，供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.510厘米。5 检测系统将通过被测试液吸收后的光信号(强度)放大，并通过显示器以数值形式显示出来，该过程中应该注意，由于随机误差原因，比较法准确度相对于标准曲线法要差一些，另外标准溶液与被测溶液浓度相差太大时有较大误差和显色反应与显色条件。检测器，又称光电转换器，常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。近年来还使用光导摄像管或
9、光电二极管矩阵作检测器，具有快速扫描的特点。（三） 紫外可见分光光度法特点分光光度法对于分析人员来说，可以说是最有用的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。分光光度法的主要特点为：1 应用广泛 由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。2 灵敏度高由于相应学科的发展，使新的有机显色剂的合成和研究取得可喜的进展，从而对元素测定的灵敏度大大提高了一步。特别是由于多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到几十万。相对于其它
10、痕量分析方法而言，光度法的精密度和准确度一致公认是比较高的。不但在实际工作中光度法被广泛采用，在标准参考物质的研制中，它更受重视，很多光度分析法已制定成为标准方法。3 选择性好目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。4 准确度高对于一般的分光光度法来说，其浓度测量的相对误差在1-3%范围内，如采用示差分光度法测量，则误差往往可减少到千分之几。5 适用浓度范围广可从常量（1-50%）（尤其是使用示差法）到恒量（10-6-10-8%）（经预富集后）6 分析成本低、操作简便、快速（四）紫外可见分光光度法的应用1 光谱
11、分析有时候需要研究某物质在某溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。 大多数情况下，比色分析都提供了使用光的波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从2001000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸收峰，再用吸收峰波长来比色分析。 咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品。图1 咖啡因样品用紫外光谱定性和定量图2 紫外可见分光光度法定性分析（1） 可作为物质定性的参考被测物质的光谱特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为2790；361.50；550.70.3nm个
12、吸收峰，完全一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。 表1 一些苯衍生物的紫外光谱特征如下表所示化合物 溶剂 吸收峰吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物 254nm250 nm 204 nm 8800 nm 甲苯 碳氢化合物 262 nm260 nm 208 nm 7900 nm 六甲基苯 碳氢化合物 271 nm230 nm 221 nm 10000 nm 氯苯 碳氢化合物 267 nm200 nm 210 nm 7400 nm 苯酚 碳氢化合物 271 nm1260 nm 213 nm 6200 nm （2） 用于有机化合物的定性和结构分析紫外吸收光谱在某种程度上反映了
13、化合物的性质和结构，所以可以用于有机化合物的定性和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对未知化合物进行鉴定，即控制相同的测量条件，将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图谱进行对照，如果两者吸收光谱的形状、吸收峰的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全一致，则可说明它们分子结构中存在相同的生色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖啡因的定性。由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单，缺乏精细的结构特征，而且很多生色团的吸收峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局限，一般必须与红外光谱、质谱、核磁共振波谱等相配合，才能进行精确的鉴定。 在测定有机物的紫外可见吸收
14、光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。表2 常用溶剂的波长范围如下 溶 剂使 用 波 长 范 围溶 剂使 用 波 长 范 围甲 醇210二 氯 甲 烷 235 .乙 醇210氯 仿 235 .水210乙 酸 乙 酯 235 .96% 硫 酸210苯 235 .乙 醚210甲 苯 235 .3 紫外可见分光光度法
15、定量分析物质含量（1） 朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律中的K称为吸光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或mol表示；如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K称为百分吸光系数，用E%表示。 E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征波长或最大吸收波长，表示为或E%nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料中可以查到，如药典规定
16、VB12应该有2781 nm、3611nm、5502nm 3个吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可以配成1mmol/L或1mol/L的浓度，相应地写成Emmol（mol）nm，max，1cm。（2) 紫外可见分光光度法定量分析根据吸光系数的特性 ，它有4项用途： 检查纯度: 紫外光谱法检查纯度是一种简便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留
17、苯，测定其吸收光谱，乙醇在210600nm之间无吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。 检查含量（纯度）:如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，浓度= 0.00247%20=0.049% 应用摩尔吸光系数测定浓度: 一般的比色分析中都有标准品，未知样品都是通过和标准溶液对比分
18、析含量。某些情况下，没有标准品，可以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进行测定，直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的吸光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需要经过精确校正了波长的分光光度计，紫外分光光度计的波长一般精确到2nm，可以承担这样的分析。如果知道分子量的话，百分吸光系数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公式是：百分吸光系数=10摩尔吸光系数物质的分子量。 比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高铁氰化钾K3Fe(CN)6和氰化钾KCN溶液中形成单体氰化高铁血红蛋白（HiCN），它的特征（最大）吸收峰在540nm处，摩尔吸光系数是1100
19、0，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。 测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算出含量。如：将血液0.02ml加入到5.0ml氰化高铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血液中Hb的含量（g/L）。第一步，计算血液稀释倍数：5.020.02=251（倍）；第二步，计算：1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为g， x=0.351100016114.5 251=128.7（g/L）。如果有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。 作为光度计使用：有色的反应液可以用普通
20、的分光光度计（721、722、浓度计），也可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应液无色，在200400nm之间有特征性光吸收，就只能用紫外分光光度计。 1. 单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一般用最大吸收波长进行比色。常用方法有2种: （1）标准曲线法：用标准液制作一系列标准管的标准曲线，样品测定结果查标准曲线求知。 （2）对照管法：制作标准测定管和样品测定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）处测定吸光度进行比较，可直接求出样品含量。如VB12含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使每含的标示量为30g/ml，另外配VB12标准液浓度为30g/ml，蒸馏水调零，用361nm
21、测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量（g/ml）=（A样品/A标准品）30；注射液中VB12含量（g/ml）=（A样品/A标准品）30 n（稀释倍数）V（取样量，ml）。 2. 混合物中两物质同时测定（两物质的最大吸收峰有部分重合），例四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25 N NaOH中最大吸收峰为380nm，E1%1cm，max =372.0；在0.1N HCl中最大吸收峰为355nm，E1%1cm，max =303.2 ；两吸收峰都可以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，因为金霉素在355nm处有吸收（金霉素在0.1N HCl中E1%1cm，max =182.6），只能用3
22、80nm测定四环素。混合样品在355nm处测定二者的总吸光度，在380nm处测得四环素的吸光度，则两者的浓度都可以求出。测定方法： （1）测定1%混合物在0.1N HCl溶液的吸光度A335 （2）测定1%混合物在0.25N NaOH溶液的吸光度A380，计算：四环素浓度C1（g%）= AC1380 / E1%（C1）1cm，380= AC1380 / 372.0 金霉素浓度C2（g%）=AC1+C2335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC1380372.0）182.64 在其它方面的应用紫外光度法广泛应用在化学、生物化学
23、、医学、环境检测、食品卫生检验分析方面。凡在200-1000nm范围内有特征性吸收，或与试剂反应后形成特征性吸收，符合郎伯比尔定律的，都可以分析。如： (1) 测定蛋白质：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸对280nm的紫外线有最大吸收，吸收值与其浓度成正比，样品不必反应，稀释后直接测定。 (2) 肌红蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要标准品，通过摩尔吸光系数法，可直接测定。 (3) 还原性谷胱甘肽：与四氧嘧啶反应，生成物在305nm处有最大吸收峰。 (4) 过氧化氢酶：有可见光测定法，也有紫外法。 (5) 抗生素：大部分可用紫外法测定，如青霉素、链霉素、氯霉素、四环素、金霉素、新生霉素。 (6)
24、 许多药物要用紫外光谱测定：如咖啡因用272.6nm；巴比妥类（安眠药）用220240nm测定；5种氯丙嗪类药（镇定药）全用249307nm测定；安眠酮用235和503nm分析；安定（镇静药）用240和285nm分析。 (7) 用于紫外比色测定：食品中硒与邻苯二胺反应，将络合物提取到甲苯中，反应物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色测定。二 紫外分光光度法测饮料中咖啡因的含量（一） 实验药品及仪器1 药品 本实验所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。（本实验所有试剂均由酒泉职业技术学院化学工程系实验室提供）（1）无水硫酸钠（2）三氯甲烷使用前重新蒸馏（3）1.5(m/v)高锰酸钾溶液: 称
25、取1.5g高锰酸钾，用水溶解并稀释至100mL。（4）亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液: 称取10g无水亚硫酸钠(Na2SO3)，用水溶解并稀释至100mL，另取10g硫氰酸钾，用水溶解并稀释至100mL，然后二者均匀混合。（5）15%(V/V)磷酸溶液: 吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。（6）20%(m/V)氢氧化钠溶液: 称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至100mL。（7）20%(m/V)醋酸锌溶液: 称取20g醋酸锌Zn(CH3COO)22H2O加入3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。（8）10%(m/V)亚铁氰化钾溶液: 称取10g亚铁氰化钾。K4
26、Fe(CN)63H2O用水溶解并稀释至100mL。（9）咖啡因标准品: 含量98.0%以上。（10）咖啡因标准储备液: 根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每mL相当于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。2 仪器紫外分光光度计。（二） 实验分析步骤1 样品的处理（1） 饮料:在250mL的分液漏斗中，准确移入10.0mL经超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入1.5%高锰酸钾溶液5mL，摇匀，静置于5min，加入混合溶液10mL，摇匀，加入30mL重蒸三氯甲烷。振摇100镒，静止分层，收集三氯甲烷。水层再加入10mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸
27、三氯甲烷定容至100mL，摇匀，备用。（2） 咖啡、茶叶及其固体制成品:在100mL烧杯中称取经粉碎成低于30目的均匀样品0.52.0g，加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移入100mL容量瓶中，加入20%醋酸锌溶液2mL，加入10%亚铁氰化钾溶液2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.020.0mL按5:1:1操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。（3）咖啡或茶叶的液体制成品：在100mL容量瓶中准确移入10.020.0mL均匀样品，加入20%醋酸锌溶液2mL，摇匀，加入10%亚铁氰化钾溶液2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静
28、置沉淀，过滤；取滤液5.020.0mL按5:1:1操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。2 标准曲线的绘制 从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为2. 00 ，4. 00 ，6. 00 ，8. 00 ，10. 00 ，12. 00 ，14. 00g/mL的标准系列，以0g/mL作参比管，调节零点，用1cm比色杯于276.5nm下测量吸光度A，得出吸光度-咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。图2 咖啡因标准曲线3 测定在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入20mL样品的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm测
29、出其吸光度，根据标准曲线（直线回归方程）求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度C（g/mL）。这时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。（三） 实验结果1 计算可乐型饮料中咖啡因含量.咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(mg/100g)咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(mg/100g) （3）式中:C样品吸光度相当于咖啡因浓度（g/mL） C0试剂空白吸光度相当于咖啡加浓度（g/mL） m称取样品的重量（g） V 移取样品的体积（mL） V1移取样品处理后水溶液的体积（mL）2 本实验条件下 本法仪器检出限为0.2g/mL，方法检出限可乐型饮料为3mg/L，咖啡、茶叶及其固体制成品为5mg/100g，咖
30、啡或茶叶的液体制品为5mg/L。标准曲线线性范围： 0.030.0g/mL。相关系数：0.999。方法回归率：90.1101.8%。相对标准偏差：4.0%。3 允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料为10%，咖啡、茶叶及其制品为15%。（四） 实验条件的选择1 吸收曲线从图3可见，咖啡因最大吸收峰，在276.5毫微米处。 图3 咖啡因吸收曲线2 pH的影响吸取10微克标准咖啡因溶液于50毫升容量瓶或烧杯中，加水至45毫升，用0.1NHCI和0.1NNaOH溶液，调节pH110。然后分别倒人250毫升的分液漏斗中，以下操作按提取(1)进行。结果见图4。 图4 pH值对
31、提取效果的影响图4说明，pH值在110范围内，对萃取效果，没有明显地差异，其吸光度稳定。说明pH在110范围内，对咖啡因没有影响，但萃取咖啡因的最佳pH范围为6.010.0；在pH6.0以一下时，当剧烈振摇时，易乳化，分层慢，在pH6.010.0没有以上现象。3 氯化钠对方法的影响取含有咖啡因毫克的样品溶液，倒人不同浓度的氯化钠溶液中进行测定，得到图5曲线。由曲线可知，氯化钠的浓度对测定方法，有明显的影响。再使用饱合盐水00.3毫升时，提取时产生乳化现象，测定结果偏低；使用饱合盐水0.51.5毫升时，其吸光度的变化，趋于平稳，回收率为98.5%，故选定饱合盐水加入量为1.0毫升，作为测定条件最宜浓度。加入饱和盐水1.sml以上时，产生大量沉淀物，其测定结果偏低。图5 氯化钠溶液浓度对提取效果影响4 萃取时间萃取摇荡时间的
