1、第十三章酶类药物第十三章酶类药物第一节药用酶概述大多数酶制剂为口服剂型，现能由于注射的酶制剂只有细胞色 素C、纤溶酶等少数几种。目前对药用酶的研究热点是，在维持活性状态下的酶蛋白能否 被吸收，如何将少药用酶的抗原性问题及新型药用酶的研究等。一、药用酶的分类及应用（一） 促进消化酶类（二） 消炎酶类（三） 与治疗心脑血管疾病有关的酶类（四） 抗肿瘤的酶类（五） 与生物氧化还原电子传递有关的酶（六） 其他药用酶二、药用酶的来源和生产（一） 药用酶的来源酶作为生物催化剂普遍存在于动植物和微生物中，可直接从生物体 中分离获得。酶可以通过化学合成法合成，但由于各种因素的限制，目前药用酶 的生产主要是直接
2、从动植物种提取、纯化和莉用微生物変酵生 产o近10多年来，动植物细胞培养技术取得了很大的进步，但因为周期 长，成本高等问题，实际应用还有一定困难。目前工业大规模生产一般都是以微生物为主要来源。（二） 生化制备法生化制备法的主要生产过程为：选取符音耍求的动植物材料一生物材料的预处理提取一纯化1、 原料选择应注意的问题(1)了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。(2)考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差别及杂 质干扰的情况。(3)用动植物组织作原料，应在动物组织宰杀后立即取材。(4)考虑生化制备的综合成本。2、 生物材料的预处理(1)机械处理(2)反复冻融处理(3)制备丙
3、酮粉(4)微生物细胞的预处理3、酶的提取（1）水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括 组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：1酶的稳定性2酶的溶解性3酶与其他物质结合的性质4选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当5（2）有机溶剂法 某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶 剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是r醇。6丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起表血活性剂 的桥梁作用。7丁醇提取方法：均相法和两相法8（3）表面活性剂法4、酶的纯化不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能
4、有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。 纯化过程中的技术难点：(1)杂质的除去1调pH和加热沉淀法2蛋白质表面变性法3选择性变性法4降解或沉淀核昔酸法5利用结合底物保护法除去杂蛋白(2)脱盐1透析2凝胶过滤(3)浓缩1冷冻干燥法2离子交换法3超滤法 凝胶吸水法(4)酶的结晶1酶的结晶方法盐析法、有机溶剂法、复合结晶法、透析平衡法、等电点法2结晶条件的选择 酶液的纯度酶的浓度 温度、时间、pH、晶种、结晶器皿处理(5)酶分离和纯化中应注意的问题1防止酶蛋白变性2防止辅助因子流失3防止酶被蛋白水解酶降解(三)微生物发酵法1、 高产菌株的选育获取优良菌株有三种途径：
5、从口然界分离筛选用物理或化学方法处理、诱变用基因重组与细胞融合技术，构建性能优良的工程菌。2、 发酵工艺的优化3、 培养方法(1)固体培养法(2)液体培养法4、影响酶产量的因素(1)温度：一般发酵温度比种子培养时略高，对产酶有利。(2)发酵的pH：可通过培养基原始pH或添加缓冲剂或通过调节 通气量曙方法实现。(3)通气和搅拌1用于酶生产的微生物，基本都是好氧菌；不同菌种在培养时， 对通气量的要求也不同。2搅拌能使气泡打碎，增加气液体接触面积，加快氧的溶解速度; 搅拌使液体形成湍流，延长气泡在培养液中的停留时间，提高 空气的利用率；搅拌可增加液体的湍流作用，有利于热交换和 营养物质与菌体细胞的均
6、匀接触，同事稀释细胞周围代谢产物, 有利于促进细胞的新陈代谢。(4)泡沫和消泡剂1泡沫的存在会阻碍二氧化碳排除，影气泡对发酵过程的影响发酵过程中， 响微生物生长和产物的形成；泡沫层过高，往往造成发酵液随泡沫溢出罐外，浪 费原料，还容易染菌；泡沫层过高还会降低发酵罐的利用率。2 IP常用消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸，胺类，酰 胺类，磷酸酯类，聚硅氧烷等。其中以聚二甲基硅 氧犹为最理想葩消疱剂。3(5)添加诱导剂和抑制剂第二节重要酶类药物的性质及生产方法一、胃蛋白酶（一）组成与性质1淡黄色粉末，具有肉类特殊的气味及微酸味；2吸湿性强、易溶于水，水溶液呈酸性。可溶于70%乙醇和 pH=4的20%乙
7、醇中。难溶于乙醍、氯仿等有机溶剂。3干燥的胃蛋白酶较稳定100度加热10 min不会被破坏；在水中, 70度以上或pH=6.2以上开始失活，pH=8以上呈不可逆失活； 酸性溶液中较稳定，但在2 mol/L盐臓中会慢慢失活。最适pH = 1.5-2.0o4结晶胃蛋白酶呈针状或板状，电泳可分出4个组分，其组成元 素有N、C、H、0、S、P、CL5胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，尤其对两个相邻芳香 族氨基酸构成的肽键最为敏感。它对蛋白质水解不彻底，产物 为豚、肽和氨基酸的混合物。（二）生产工艺1、工艺流程酸!过滤=山（人IICIli 181 In脫脂、Z杂质21- 2Rh2、工艺过程及控制要点
8、酸解，过滤2脱脂，去杂质3浓缩，干燥3、胃膜孝和胃蛋白酶联产工艺1、胃诫、素也是从猪胃粘膜中提取的一种黏蛋白。胃膜素水溶液能被60%以上的乙醇或丙酮沉淀，所以可利用提取胃膜素的母液制备胃 蛋白酶。2联产工k:向分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至相对密度 0.91,既有淡黄色胃蛋白酶沉出，静置过夜，去上清液，沉淀真空 干燥，即得胃蛋白酶。34、结晶胃蛋白酶的制备2、活力测定取试管6支，其中3支各精确加入对照品溶液IrnL,另3支各精确加人供试品溶液 lmL,摇匀，并准确计时，在（37 士 05）C水浴中保温Smin,精确加入预热至（37 士每克含蛋白酶活力单位=AXW.Xn人XWX1CX1
9、81门05）C的血红蛋白试液5mL,摇匀，并准确计时，在（370.5）七水浴中反应lOmin。寸即 精确加人5%三氯醋酸溶液5mL,摇匀，滤过，弃去初滤液，取滤液备用。另取试管2支, 各精确加入血红蛋白试液5mb,置（370.5）工水浴中，保温lOmin,再精确加入5%三氯 醋酸溶液5mL,其中1支加盐供试品溶液ImL,另-支加酸溶液山1一摇匀，过滤，弃夫初 滤液，取续滤液，分别作为对照管。按照分光光度法，在波长275nm处测吸收度，算出平 均值儿和A,按下式计算对照品的平均吸收值式中A供试品的平均吸收值;W供试品取样量，g；丫化对照品溶液中含酪氨酸的量，卩g/mL； n供试品稀释倍数。一、是
10、一2巾碱性蛋白，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿 中。人尿中平均含量5-6IU/mLo临床上尿激酶已经广泛用于 治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。（一）结构与性质1 普讎家學品躬黑醫天製議番蝌耀尊養号胃删蠶酶。存在多种相对分子质量形式，主要的有31300、54700两种。3尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必须4尿盂酶匾专一性很强的蛋白水解酶，尿激酶也有酯酶活力。5尿激酶PI为89,溶液中不稳定，冻干可稳定数年。（二）生产工艺沉淀Ef2(),HCI験化1 _ _男性尿-10忙phT丁尿上清液-巴匕沁二二 酸化尿- 抚萄u Tfc SV亠硅漢土吸附物一1硅藻土柱1、工艺流程
11、rttM I o 竊 i洗脱”斟豐厂CMC化洙 亦液佬帥删4/ +沁竺斬.竺竺透析液卫竺成品2,王艺过程及质量控制（1）收尿 收集男性尿，所收集的尿液应在8h内处理e尿液pH值应控制在65以下, 电导相当于20-30MQ-1.细菌数在1000个加L以下（2沉淀处理 尿液徐至10C以下，用NaUH调至pH = & 5,静置！h,虹吸上潸液 用盐酸调至pH二5.055。（3）硅藻土吸附 处理好的尿液加人1%尿量的硅藻土，于FC以下攬拌吸附lh洗脱 硅藻土吸附物用5C左右拎水洗涤.然后装柱，先用0. 02%氨水加0.1氯化钠洗脱！当洗脱液由清变浑时开始收集，每吨尿约可收集15L洗脱液,（5）除热原和
12、色素 上述收集液用饱和磷酸二氢钠调pH = 80,加氯化钠调电亍相半 于22MQ-X通过QAESEph&kx层析柱，收集流岀液。柱用三倍床体积磷酸缓冲液洗，洗 液与流岀液合并。（6） CMW浓缩 上述收集液用1 mol/L醋酸调pH-4.2,以蒸懈水调电导到相当于 117M1T爲通过CM-C层析柱。然后用倍床体积量的pH-4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液 洗涤柱床后，改用0.1%氨水加0.1 mol/L氯化钠洗脱尿激酶，分步收集流出液。（7） 透析除盐 洗脱液于对水透析24h,透折液离心去沉淀，冻干即得成品。成品为白色或米色澄清溶液或白色冻干粉。每毫克蛋白的酶活力不得低于120000 IUo尿激酶活
13、力测定方法：(1)气泡上升法1试剂：血纤维蛋门原溶液、牛凝血酶溶液、血纤维溶酶原溶液、 尿激酶标准品溶液。2反应体系：四种溶液的混合体系。3操作：12 mm*75 mm小试管，置于冰水浴中，依次加入上述溶 液，迅速搅拌，立即置于37度水浴保温。反应体系应在30-45S凝 纟苗凝块内有小气泡生成。当锻块溶解吋，气泡逐渐上升，在气 疱上弁至i反检体系徉积一半时確为皮应终点。4标准取消：以酶浓度为纵坐标，凝块溶解时间为横坐标，绘制标 准曲线。5样品加嘔被测样品稀释成10-20IU/ML,同以上操作，根据凝 块溶解时间，从标准曲线查得样品的活力单位。(2)平板法试剂比血纤维蛋白原：0.25%质量体积分
14、数溶液。瘠解液为17份生理盐水，1份 O03moI/L. pH-7.8磷酸缓冲液。b凝血酚溶液：用生理盐水配成60单位/mL。c.磷酸缓冲液：0. 03mol/L, pH = 7. 8Od.明胶溶液：用0.03mo/LpH=78磷酸缓冲液溶解明胶，配成0.】明胶溶液。&尿激酶样品：用明胶溶液配成适当浓度。Vl擁朋 在直径为10. Scm平皿里，加入17mL纤维蛋白原溶液，再加入0. 4mL凝血 酶溶液，快速摇匀(不能出现气泡和血丝儿静置0. 5h0擬结后平板应垠本透明无色，用微 量注射器点样20PL,同时点上稀释成不同浓度的标准品9覆以玻盖。于37匸温箱中保温 】8h后取出，用卡尺测出溶圈垂直
15、两直径，相乘得一积。以溶圈直径乘积为纵坐标，标准晶 酶的百分浓度为横坐标作图，即可在图上查岀样品的活力单位。三、门冬酰胺酶（一） 结构与性质1门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药 物，可用于治疗白血病。2呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醸及甲醇。320%水溶液，室温储存7天，5度储存14天均不减少酶的活力。干品 50度，酶活力降低30%, 60度lh内失活，最适pH=8.5,最 适作用温度37度。（二） 生产工艺1、工艺流程阿种培菲！ 种了培养 发酵 “压滤,凤干： 提取大时弓豐游肉亦种責豎府种子液看貲孑亠干時律:加提取液2、工艺过程及控制要点发酵罐
16、培养玉米浆培养革，接种fi 8%37*0通气搅拌培养68h,离心分离发酵 液得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成薦体于粉。提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉加入0. 01 mol/L pH=& 3的硼酸缓冲液10L, 37电保温搅拌l5h,降温到309以后用5mol/L酸调节pH-1.2-4-4进行压滤，滋液中加入2倍体积的丙酮-放胃：34h,过滤，收集沉淀，自然风干，即得粗制爾取粗制輪，加入0.3%甘氨酸溶液，调节pH8.8,搅拌1.5h,离心，收集上清液, 加热到60C 30rnin进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加2倍体积的丙酮.析出沉淀.离 心，收集酶沉淀，用O.Olmo
17、I/I八pH = 8磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶 溶液。精制*冻干 取上述酶溶液调节pH=-8-8.离心弃去沉淀，清液再调pH = 77加入 50%聚乙二醇，使浓度达到16%.在25C放置4-5d,离心得沉淀。用蒸憎水溶解，加4倍最的丙酮、沉淀.同法反复1次, 件下用&号垂熔漏斗过滤，分装，沉淀用pH=6.4、0. 05rwol/L磷酸缓冲液，左无茵条 冷冻干燥制得注射用门冬酰胺誨成品，每支10000U或 20000U.（三）活性测定方法1测定原理：门冬氨酸酶催化天冬酰胺水解，释放游 离氨。奈斯勒试剂与氨反应后形成红色配合物，可 借比色法连行定量测定。2!1!实验过程：取0.04
18、mol/L的L天冬酰胺1 ml, 0.5mol儿pH=84的硼酸缓冲液、0.5 ml细胞悬 浮液或裾液，于37度永溶液申慄温15 min,加 15%三氯醋酸0.5 mb以终止反应。沉淀细胞或 酶蛋白，离心，取上清液1 itiL。加2itiL奈斯勒试 剂和7 mL蒸Y留水15 min后，于500 nm波丧卞比 色测定产生的氨。活力单位定义：每分钟催化天冬酰胺水解1 umol 氨餉酶量定为一个洁另華彳立。四、超氧化物歧化酶（SOD）o SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能专一清楚超氧阴离子自 由基。o目前SOD临床应用集中在自身免疫性疾病上，也可用于抗辐射, 抗肿瘤，治疗氧中毒，心肌缺氧与缺血再灌
19、注综合症一级某些 心血管疾病。0 SOD属于重金属酶，广泛存在于动植物、微生物细胞中。（一）结构和性质SOD的性质不仅取决于蛋白质部分，还取决于活性中心金属离 子的存在，金属离子种类不同，SOD的性质有所不同，其中 Cu, Zn-SOD与其他两种SOD差别较大，而Mn-SOD与 SOD之间差别较小。2、SOD的理化性质SOD是一种金属蛋白，因此它对热、pH及其在某些性质上表 现出异常的稳定性。(1)热稳定性(2)pH对SOD的影响o 在pH = 5.3-10.5范围内对SOD活性不受影响。o pH = 36时SOD中Z n要脱落95%。o pH = 12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，
20、从而导致酶 居性丧失。(3)吸收光谱0 取决于酶蛋白和金属辅基。0 紫外光谱区：250 nm-270 nmo 可见光区：680 nm4、金属辅基与酶活性Cu与Zn的作用是不同的o Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关。o Cu与催化活性有关，透析除去Cu则酶活性全部丧失，一旦重新加入Cu,酶活性又可以恢复。表13$ SOD的分子組成及某些理化性质SOD光壊梆对分子 质址含冇金属数眾大光吸:收/nm氮亘酸纽痕持点lmol/LKCN抑制处理过氧址物紫外可见CuZn-SOD320002C“22n258680酪氮酸和色氨酸缺乏由显抑制明屈.失活有Mn-SUI)440002Mn280475含酪氨酸和
21、色俎酸无无影响X800004MnFlSOD4VOOOZFeZ8U350含酪氨酸和色氨酸无 ；明显天活（二）生产工艺分离和纯化SOD常根据原料、种类和性质的菱异而有所不同。现以从牛血红细胞中提 取Cu, Zn-SOD为例.介绍制备Cs Zh SOI）工艺。牛红细胞提取Qu, Zn-SOD的工艺漩程昭牛血一票红细叱据缶干净红细胞聽吕溶血液占鬻貯上清液空誉丄沉淀物一硃汗粉（城品）上驾皆匚粗制浓缩液些曲严f 浓缩液0SOD甜提滋十SO q 70X, wIOhijji1、 收集红细胞2、 溶血、去血红蛋白3、 沉淀、热变性4、 柱层析5、 冷冻干燥（三）检测方法1、 SOD的纯度鉴定酶尿活 藝眇理北性质
22、2、 SOD活性测定（1黄璟吟氧化酶-细胞色素C法（Mcccnl J M & Fridovich I.经典法.简称55（）nm法1酶活单位定义 一定条件FBmL的反应液屮，毎分钟抑制氧化型细胞色素还原 率达50%的薦最为一个活力单位。2测定系统 05mL, pH = 78, 300mn）oi7L磷酸缓冲液.其中含0. 6mmnl/L的FT）-TA： 0. 5mL, 氧化型细胞色索C溶液；0. 5niL, 0. 3mmol/L黄嗓吟洛液,1.3mL燕幡水，在25P保温iOmin.最后加入02mL, 1. 7X10 3U,rng蛋白的黄嚷吟氣化 酶溶液并立即计时，速率变化在2min内有效，要求还原
23、速率控制在每分钟0O25A测 定活性肘，加入03mL被測$（）D溶液，蒸馆水相应减至l.OmL,并控制SOD浓度，便氧 化中细胞色素C还原速率的SOD值降为0. O125A/mme3SOD活性计算公式0025加酶后还原速率_弓活性皿）= 7令X嚮瞒式中卩总；V=3 : 3。（2）微最连苯三酣自氧化法（简称325nm法） 活性单位定义 在定条件下.ImJ.S应液中，每分钟抑制连翠三酚衣波长 处自氧化速率达50%的醉崑定为一个活性单位。测定系统2. 99niL, pH 8 2, 50mnioi/L tris-HC1 缓冲液其中含 lnimoi/LEDTA-2Na在25七预保温lOrnin,晟后加入
24、约10pL, SOmrnl/L联苯三酚（配制于 lOmmol/L HCI中）.使反应体积在3mL,计时，自氧化速率变化在4min内有效，控制连 苯三酚自氣化速率为0070A/mim。测SOD活性时，加入约4. 0怕L的SOD溶液.缓冲液相 应滅至295ml“.并控制SOD浓度，使联苯三酚自氧速率降为0. O35A/min左右。计算公式6 070-加酶后自繼化速率SOn活性咧畿 X令X驟驚五、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)0 一类存在于人体组织中的组织激活剂。主要由血管内皮细胞和 组织细胞合成，存在于哺乳动物血浆中。0 主要作用：作用于纤维蛋白溶酶原，特异性裂解溶酶原中的精 氨酸-结贝氨酸键。t
25、PA与纤维蛋白结合产生的卜PA纤维蛋白复 合物，能高效、特异地激活血凝块中的纤溶酶原，因此是一种 高效特异性血栓溶解药物。卜PA释放减少见于高脂血症病人，尤其是高三酰甘油血症、肥 胖症、口服避孕药等的病人。0 tPA的活性在夜间及清晨最低，白天可增高达3倍，说明内皮 细胞合戒与分泌tP A述与时间有关。(一)氨基酸特征20(图132 t-PA的氨基酸庠列结构（二） 理化性质及生物学活性t-PA的等电点在7.8-8.6之间，稳定pH为5.8-8.0, 最适pH为7.4； JPA在枸椽酸抗凝血浆中不稳定， 其活征丧失速度与温度有关。（三） t-PA的生产可利用动物细胞培养技术，培养人黑色素瘤细胞株， 产生大量的t-PA,其培养液中t-PA浓度可达到1 ml/mLo1、工艺流程细庖单层丄色竺劉他息酒丄姙细胞培养物住-堵养液提缪-捉取液空析丸灶足析液卫型推縮液-PA成品黒-匚只析液返如Q-
