1、香豆素衍生物荧光分子探针的合成及性能研究毕业设计论文1 精品齐 齐 哈 尔 大 学 毕业设计（论文）题 目 香豆素衍生物荧光分子探针的合成及性能研究 学 院 化学与化学工程学院 专业班级 学生姓名 指导教师 成 绩 2012年6月12日摘要以香豆素-3-甲酸为原料，经氯乙酰化得中间体香豆素-3-甲酰氯，进一步与2-吡啶-8-氨基喹啉反应，得荧光分子探针(SHK-1)；香豆素-3-甲酰氯与过量的乙二胺反应合成得到SHK-2；2-吡啶-8-氨基喹啉经氯乙酰化得中间体，进一步与无水哌嗪反应，最后与香豆素-3-甲酰氯合成得SHK-3。上述产物的结构经1H-NMR表征，均为目标产物。经初步筛选后，研究了
2、荧光分子探针SHK-1在中性缓冲溶液中对金属离子的识别性能。结果表明，SHK-1可以选择性荧光猝灭识别Cu2+、Fe3+。SHK-1与Fe3+络合后，SHK-1在波长为351nm处，荧光峰强度猝灭31%；与Cu2+络合后，SHK-1在474nm处，荧光峰强度几乎完全猝灭，猝灭比率达97%。定量分析显示，SHK-1与Cu2+形成了1:1型络合物。金属离子竞争实验表明，常见的金属离子均不干扰SHK-1对Cu2+的检测。关键词：香豆素；荧光分子探针；Cu2+Abstract Coumarin-3-methyl chloride was synthesized using the raw marter
3、ial coumarin-3-formic acid through chloroacetylation. which were used as mediums of synthesizing complicated fluorescent probes. Furtherly, used coumarin-3-methyl chloride and 2-pyridine-8-aminoquinoline, fluorescent molecular probes SHK-1 was designed and synthesized through reaction. SHK-2 was syn
4、thesized using the coumarin-3-methyl chloride and excess ethylenediamine. 2-pyridine-8-aminoquinoline was chloroacetylated using the raw marterial , which is the mediums of synthesizing complicated fluorescent probes. And then further reaction with anhydrous piperazine, finally the SHK-3 was synthes
5、ized through coumarin-3-methyl chloride. The structure was confirmed by 1H-NMR characterization of the above products, are the target product. After initial screening, fluorescent molecular probes of the SHK-1 was studied in the recognition performance of the metal ions in the neutral buffer solutio
6、n. The results show that SHK-1 can be selective fluorescence quenching identification of Cu2+,Fe3+.After complexation with Fe3+, at the wavelength of 351nm, the fluorescence peak intensity quenching of 31%; After complexation with Cu2+, at the wavelength of the 474 nm, The fluorescence intensity is
7、almost complete quenching, the quenching ratio of 97%. Quantitative analysis showed that SHK-1 formed a 1:1 complex with Cu2+. Metal ion competition experiments show that the detection of SHK-1 for Cu2+ did not been interfered for the common metal ions.Keywords: Coumarin; Fluorescent molecular probe
8、s; Cu2+目录摘要 IAbstract II第1章绪论 11.1概述 11.1.1荧光的定义 11.1.2荧光产生的原理 11.2荧光探针 21.3香豆素类荧光探针的研究进展 21.3.1香豆素及其衍生物在各个领域中的应用 21.3.2香豆素类化合物 31.4本研究工作的主要内容及意义 6第2章实验部分 82.1实验药品与仪器 82.1.1实验药品 82.1.2实验仪器 92.2 实验操作 92.2.1 SHK-1的合成 102.2.2 SHK-2的合成 102.2.3 SHK-3的合成 112.2.4 SHK-4的合成 112.3 识别性能测定 102.3.1 溶液的配置 102.3.2
9、 测定方法 11第3章结果与讨论 123.1 核磁1H谱解析 123.1.1 SHK-1的1H谱解析 123.1.2 SHK-2的1H谱解析 133.1.3 SHK-3的1H谱解析 143.2 SHK-1对常见金属离子识别的选择性 153.3 Cu2+浓度对溶液光谱的影响 163.4 其它金属离子对探针识别Cu2+光谱的影响 17结论 19参考文献 20致谢 23第1章 绪论1.1 概述1.1.1 荧光的定义荧光是一种光致发光的冷发光现象。常温下，当用紫外光或可见光照射某些物质时，这些物质吸收光能而处于激发态并在极短的时间内(10-8s)发射出比入射光波长长的光线，并且发射出的光线的波长和强度
10、各不相同，而一但停止照射后，这种光也随之消失，这种光被称为荧光，能发出荧光的物质称为荧光物质1-3。1.1.2 荧光产生的原理物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子，该分子受到激发，原来处于基态的电子在很短的时间内(10-15s)级跃迁到较高能级，跃迁前后两个能级间的能量差等于分子受到激发时吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子被光子激发，随即发生电子能级间的跃迁，处于这种激发态的分子称为电子激发态分子。此后，由于分子处于激发态及其不稳定，其通过内转换过程把部分能量转移给周围分子，使较高激发态的电子很快回到最低激发态的最低振动能级。即通过辐射的方式返回
11、基态。辐射的衰变过程伴随光子的发射，即产生荧光。图1.1为分子内所发生的激发过程以及辐射跃迁衰变过程的示意图。荧光分子在未被照射前一般处于基态单重态S0，在吸收入射光的光子能量后，分子被激发。分子中的电子容易从S0跃迁至激发单重态S1、S2。高能量的单重激发态分子通过无辐射跃迁回到激发态的最低能级S1，处于S1的分子寿命一般为10-4-10-8秒，它们会通过辐射衰变返回基态S0。，此过程会伴随光子的产生，这就是荧光4。E：能量；F：荧光；ic：内转换图 1.1 荧光的产生过程1.2 荧光探针荧光探针是一类在紫外-可见-近红外光区有特征荧光，并且其荧光性能(激发波长、发射波长、强度等)可随所处的
12、环境的性质，如极性、浓度、折射率等方面的变化而灵敏地改变的荧光性分子5。它能将分子识别事件通过荧光信号有效表达出来6。它广泛应用于金属阳离子7-9、阴离子10和中性分子11等被分析物的荧光识别检测。在众多的分析方法中，荧光分子探针及其技术具有灵敏度高、选择型好、使用方便、成本低、不需预处理等诸多优点12，因此近年来受到化学界、生物学界和医学界12,13的广泛关注。荧光探针一般是由荧光基团和识别基团通过连接基(共价键)相连而成，各基团起不同作用。荧光团起到把识别事件以光学信号的形式表达出来;识别基团起到选择性的和客体结合的作用，即事件的识别14。荧光探针是统一的整体，不是基团简单的叠加，因此在荧
13、光探针的设计合成中必须二者兼顾。当识别基团与被分析物结合时会引起荧光基团的化学环境发生变化，通过颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的增减等现象来表现，这些变化可被裸眼或者仪器识别。这是目前为止在设计荧光探针中应用最广泛的方法 。 1.3 香豆素类荧光探针的研究进展香豆素又名1，2-苯并吡喃酮(分子式如下)，广泛存在于自然界中的一种内酯类化合物，天然存在于芸香科和伞形科植物中最多，其次是黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰、兰花等中，少数来自微生物。由于它具有抗艾滋病，抗肿瘤，抗氧化，抗微生物，降压，抗辐射等多方面的生物活性以及良好的光学特性等优点，被广泛应用于各个领域15,16。1.3.1 香豆素及其衍生
14、物在各个领域中的应用研究表明，在医药领域中香豆素类化合物具有多方面独特的生理学和生物学活性，对人体具有例如：抗高血压、抗凝血、抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗癌等一系列的生物和药用活性。近年来发现香豆素类化合物还具有神经保护、抗高尿酸血症抗氧化、抗衰老以及抵抗当今危害人类健康的顽症AIDS和肿瘤方面有较好的药物活性17-20。香豆素类衍生物也是重要的医药中间体，如4-羟基香豆素，是一类抗厌氧菌类药物。这类的4-羟基香豆素的衍生物，是维他命K的拮抗剂，也是一种是用于生产口服性抗凝血药物华法林等的原料21。7-羟基-4-甲基香豆素能松弛肌肉，具有较强的镇痛作用，同时也能较为温和、并且持续地促进胆汁的分泌
15、，加强抗菌作用，具有明显的利胆作用，用于利胆药物的合成。由于香豆素类荧光染料具有极高的荧光效率和Stokes位移大等优异的特点，成为近几年来有机荧光染料研究的重点之一。该类染料属高档次的荧光染料，是荧光染料中重要品种(表1)，具有发射强度高、色泽鲜艳、荧光强烈等特点15，主要用作荧光溶剂染料和荧光有机颜料，它们着色品的特点是鲜艳、醒目。该类染料中的一些品种还可用作激光染料并具有良好的应用性能。表1 三类主要香豆素类荧光衍生物类别结构式用途荧光增白剂耐热性、耐湿及耐氯性能均较好。适用于涤纶，醋酸纤维、尼龙等纤维及聚酯树脂原液的增白。溶剂染料广泛用于聚苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、日用工艺品装饰
16、品、荧光油墨等。荧光染料具有更优良的牢度性能和溶解性能。作为荧光染料应用于太阳能手机契合激光器。香豆素类荧光因为苯并吡喃酮结构，具有荧光量子产率高、Stokes位移大、光稳定性好等优点，是荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团，在分析领域中有重要的应用。最新研究发现，应用于多糖和糖蛋白的检测时，将几种香豆素类(如3-羟基香豆素、3-氨基香豆素、3-羧基香豆素和4-甲基-7-羟基香豆素)作为新基质，每个激光点照射样品均能产生较强的质谱信号，且谱图重现性更好，为分析多糖和糖蛋白提供了更多可以选择的新基质15,22。香豆素类化合物具有荧光量子产率高、Stokes位移大、待分析物质经衍生化可大大增强其荧
17、光响应提高检测灵敏度和选择性、有稳定分析物的作用，尤其针对那些活泼的和有挥发性的化合物、有助于化合物基团的确证光物理和光化学性质可调等优点，是荧光探针分子设计中的优秀候选荧光团23-25。因此近年来香豆素类荧光探针的设计、合成逐渐成为一个新兴的研究热点。1.3.2 香豆素衍生物类荧光分子探针在香豆素的6或7位引入供电子基团，3或4位引入吸电子基团得到具有“推一拉”电子体系的衍生物26-28,29，它们与不同的阳离子受体结合即可得到基于PET或ICT机理的荧光传感器30。2009年，Mi Hee Kim31等人，设计合成了化合物香豆素1，它是将香豆素334和联氨反应，其中醛基上氧原子被联伯胺氮原
18、子取代。化合物1在与Cu2+的配合下显示其荧光性。因为铜离子对各种胺配体显示很高的亲和力，铜离子势必与1键合，这反过来又促进1中腙键的水解。水解产物和铜离子分离，铜离子又结合到另一个1上，随之又促进了通过催化传感器周期腙键的水解。最后催化周期诱导和放大荧光信号。2009年，熊敏秋11小组用7-羟基-4-甲基香豆素与二溴丙烷设计合成了化合物2，并且在化合物2的基础上分别与不同化合物合成3、4、5。化合物25均能使三聚氰胺的荧光(em355 nm， If, max36 a.u.)猝灭，其中化合物24的荧光光谱没有因加入三聚氰胺而发生变化。当在化合物5中加入三聚氰胺时，其荧光光谱发生了明显的猝灭现象
19、，说明荧光探针化合物5对三聚氰胺具有识别作用。 2009年，郭媛32等合成了2种香豆素类荧光化合物6，8-二氯-7-羟基-香豆素-3-羧酸(6)和6-氯-7-羟基-香豆素-3-羧酸(7)，其中化合物5未见文献报道。分别测定6和7在石油醚、乙醚、乙醇、甲醇和水中的紫外和荧光光谱。结果发现，溶剂的极性较大时，紫外最大吸收波长较大。而同样浓度的荧光光谱中观察到，6和7在极性较大的乙醇、甲醇和水中的荧光强度比极性较小或无极性的乙醚和石油醚中荧光强度明显强，而且最大发射波长发生红移。 2008年，Lin课题组33提出了一种新的策略来增强化学计量计型探针的荧光比值，通过修饰探针上的电子结构来调节分子内的I
20、CT过程，进而达到与待测物发生作用前后荧光比值变化大的目的。设计合成了化合物8，证明上述策略的有效性。 2001年，Plater34等将邻苯二胺与香豆素反应合成了NO的荧光探针9。邻苯二胺部分可以用甲基或甲氧基取代，能够更进一步增强其给电子能力。芳香胺的电子通过PET转移到激发态荧光团的最低能量空轨道上导致荧光淬灭。而与NO等络合后能把邻苯二胺部分转换成具有较高的氧化电位的缺电子的苯并三唑衍生物，PET被抑制，荧光增强。1997年，Brunet35等设计合成基于-二碳基的香豆素类Mg2+荧光探针10。在其它碱土金属离子存在下，10选择性识别Mg2+，Mg2+和-二羰基容易形成络合物，使得香豆素
21、的3位吸电子能力增强，ICT效应也加强，荧光激发波长和发射波长都发生红移。Suzuki36等同样也设计合成了-二羰基类Mg2+荧光探针11、12。11、12与Mg2+形成1:1络合物，使ICT效应加强，荧光激发波长和发射波长都发生红移。2009年，林卫英等37将哇琳接到香豆素衍生物母体上，合成了一种新型的香豆素荧光探针13。Ni2+或Co2+离子可与香豆素喹啉化合物络合，因此在Ni2+或Co2+离子存在下，香豆素喹啉化合物的荧光增强。 2009年，李和阳等38通过两步有机合成，得到7-羟基-3-烯胺香豆素l4。该香豆素衍生物在乙睛溶液几乎没有荧光，然而在锌(II)离子存在下，能最大吸收显示出红
22、移，从374nm红移到452nm，肉眼观察到由无色变为黄色，且其它金属离子不存在这种效应。1.4本研究工作的主要内容及意义虽然基于香豆素类构造的荧光分子探针用于金属离子识别，但由于合成方法复杂、收率低、检测条件苛刻等，而且还有一部分香豆素类化合物的衍生物荧光分子探针的研究进展还不丰富。因此人们一直在努力设计、合成新型荧光分子探针，以满足各种不同的研究需要。根据荧光分子探针识别的基本原理，结合本组相关研究取得的积累，主要进行了香豆素类荧光分子探针的设计、合成及性能的研究。由于近年来香豆素类化合物作为荧光分子探针的识别基团得到了广泛应用；而且香豆素荧光基团具有荧光量子产率高、荧光发射波长适中、斯托
23、克斯(Stocks)位移大、光稳定性好、分子易于修饰等优点，在荧光染料、激光材料、光电转换材料、荧光标记、荧光探针等方面都得到了广泛应用，因此本实验中选用该荧光团。本论文的研究工作是根据荧光分子探针的基本作用原理，结合前人的工作，主要进行香豆素衍生物类金属离子荧光分子探针的合成及识别性能研究。第2章 实验部分2.1 实验药品与仪器2.1.1 实验药品实验所用试剂与原料如下表2-1表2-1 试剂及原料一览表药品名称分子式纯度级别生产厂家二氯甲烷CH2Cl2分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司氯仿CHCl3分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司乙酸乙酯CHCOOCH2CH3分析纯(AR)天津
24、市凯通化学试剂有限公司甲醇CH3OH分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司乙腈CH3CN分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司吡啶C5H5N分析纯(AR)中国医药(集团)上海化学试剂公司无水乙醇CH3CH2OH分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司C8,560-3C10H6O4分析纯(AR)Aldrich Chemical Company氯化亚砜SOCl2分析纯(AR)国药集团化学试剂有限公司无水哌嗪C4H10N2分析纯(AR)国药集团化学试剂有限公司乙二胺C2H8N2分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司无水硫酸钠Na2SO4分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司碘化钾KI分析纯(
25、AR)天津市凯通化学试剂有限公司1,3-丙二胺(CH2)3N2H4分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司氯乙酰氯ClCH2CClO分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司DIPEAC8H19N分析纯(AR)ACROS ORGANICS三乙胺(C2H5)3N分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公司喹啉C9H7N分析纯(AR)上海金山亭新化工试剂厂氯化亚锡SnCl2H2O分析纯(AR)国药集团化学试剂有限公司氨水NH4OH分析纯(AR)哈尔滨市化工试剂厂30%盐酸HCl分析纯(AR)哈尔滨市化工试剂厂硫酸H2SO4分析纯(AR)长春化学试剂厂硝酸钠NaNO3分析纯(AR)天津市凯通化学试剂有限公
26、司氢氧化钠NaOH分析纯(AR)天津市风船化学试剂有限公司氮气N2分析纯(AR)黎明气体柱色谱硅胶分析纯(AR)青岛海洋化工厂 2.1.2 实验仪器实验所用主要仪器如下表2-2表2-2 主要仪器一览表仪器名称型号生产厂家磁力加热搅拌电热套84-1山东省鄄城新华电热仪器厂平板式磁力搅拌器78-1杭州仪表电机厂磁力加热搅拌器79-HW江苏省金坛医疗仪器厂显微熔点测定仪X-6北京泰克仪器公司手提式紫外观测灯UV-5北京智源生物技术研究所循环水真空泵SHZ-B浙江临海市精工真空设备厂循环水式多用真空泵SHZ-CD河南巩义市英峪予华仪器厂电子天平BS200S-WEI北京赛多利斯仪器系统有限公司电热鼓风干
27、燥箱101-O黄骅市航天仪器厂箱式电阻炉R-J-X-4-13天津华北实验电炉厂电阻炉温控仪DRZ-6天津华北实验电炉厂旋转蒸发器RE-52AA上海亚荣生化仪器厂玻璃仪器气流烘干器KQ-B巩义市英峪予仪器厂超声波清洗器SK2200H上海科导超声仪器有限公司超声波振荡器SK2200P上海科导超声仪器有限公司电子分析天平BS210S北京赛多利斯天平有限公司标准型pH计PB-20Sartorius荧光分光光度计F-4500Hitachi公司紫外-可见光分光光度计TU-1901北京普析通用仪器有限责任公司超声波振荡器SK2200P上海科导超声仪器有限公司石英自动双重纯水蒸器1810-B型江苏金坛超声波清
28、洗器HK5200上海汉克科学仪器有限公司2.2 实验操作2.2.1 SHK-1的合成：(1) 香豆素-3-酰氯的合成：称取1002mg(5.27mmol)香豆素-3-甲酸于圆底烧瓶，先加入5mL的氯化亚砜，再加入34滴吡啶，加热回流6小时后，减压蒸除过量的氯化亚砜，经石油醚重结晶得乳黄色晶体得到879mg。产率为88%，m.p.144145。(2) SHK-1的合成：合成的香豆素-3-甲酰氯93mg(0.532mmol)溶于20mL二氯甲烷中移入恒压滴管内；称量103mg(0.448mmol)2-吡啶-8氨基喹啉、49mg(0.616mmol)吡啶溶于10mL二氯甲烷中。向上述溶液于0.5h内
29、滴加香豆素-3-甲酰氯溶液，滴加完毕后再搅拌1h后，减压浓缩溶液，柱分离(CHCl3/AcOEt=10：1(v/v)，Rf=0.62)，收率为53.5%，m.p.185187.3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (*10-6): 12.94 (s, 1H), 9.25 (d, J = 8.0Hz, 1H), 9.20 (s, 1H), 9.00 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.80 (d, J = 4.0Hz, 1H), 8.58 (d, J = 12.0Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.0Hz, 1H), 8.12(t, J = 8.0Hz,
30、1H), 7.80 (t, J = 10.0Hz, 1H), 7.65 (t, J =10.0 Hz, 1H).2.2.2 SHK-2的合成：称量182mg(0.87mmol)上述实验中已合成的香豆素-3-甲酰氯溶于10mL氯仿中，冰浴下与26mg(0.44mmol)乙二胺反应，搅拌0.5h，室温下搅拌1h后停止反应。浓缩溶液，柱分离(CHCl3/AcOEt=30:1)(v/v)，Rf=0.43)，收率为52.7%，m.p.112.0114.2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (*10-6): 13.51 (s, 1H), 8.59 (s , 2H), 7.44 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.34 (t, J = 4.0 Hz, 2H),6.91 (t, J = 4.0Hz, 2H), 6.88 (d, J = 4.0Hz, 2H), 3.70 (t, J =6.0 Hz, 4H).2.2.3 SHK-3的合成：(1) 2-吡啶-8-乙酰氯基喹啉：将118mg(0.51mmol)2-吡啶-8-氨基喹啉、83mg(1.05mmol)吡啶溶于20mL二氯甲烷中，冰浴下0.5h内滴加氯乙酰氯
